论文部分内容阅读
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是尚未解决的世界性难题。减少继发性脊髓损伤,一直是研究的热点。而巨噬细胞则是参与脊髓继发性损伤的主要细胞。巨噬细胞具有极化特性,可以极化为M1型与M2型,M1型具有神经毒性,而M2型巨噬细胞可分泌神经营养因子并促进轴突再生。在SCI后,M1型为主的巨噬细胞在损伤区占据主导,进一步导致了脊髓的不可逆损伤。以往研究已证实,通过调节损伤区中巨噬细胞的极化状态,降低M1型巨噬细胞的数量,增加M2型巨噬细胞的表达,促进神经营养因子的分泌情况,可以有效改善SCI的修复情况。然而,目前调控巨噬细胞极化的方法存在着种种不足,亟需寻找一种更加安全有效的治疗手段。弱激光治疗(Low Level Laser Therapy,LLLT)是指利用低功率激光的生物学作用,进行局部照射,从而达到治疗效果。因其无创、抑炎、促修复的特点,目前已在多个临床领域应用。既往研究已经证实,810-nm LLLT可以改变SCI大鼠损伤区巨噬细胞的极化状态,有效促进SCI后大鼠的功能恢复。然而,尚不清楚LLLT是否可以直接作用于巨噬细胞,调控其极化状态,增加神经营养因子的分泌情况以促进神经轴突的再生,且这一作用又是通过何种具体机制实现的。此外,近年来的研究证实,神经元与巨噬细胞之间也存在着交互性作用,巨噬细胞的极化状态也受到神经元的分泌状态的影响。神经元分泌的C-C motif ligand 2(CCL2)因子,可改变巨噬细胞极化状态,促进巨噬细胞向M2型方向极化。然而810-nm LLLT对巨噬细胞与神经元交互作用是否会产生影响,又是怎样实现的,尚不得而知。针对以上问题,开展以下两部分实验进行研究。实验一:810-nm LLLT对巨噬细胞分泌神经营养因子促进神经轴突再生的影响及相关机制研究目的:研究LLLT对M1型巨噬细胞极化状态及神经营养因子分泌的影响及其机制。方法:建立LLLT-M1巨噬细胞体外照射模型。使用红外光源(波长,810-nm;功率密度,2mW/cm ~2;照射面积,4.5cm ~2;照射时间,440s)进行照射,得到4J的能量(2 mW/cm~2×4.5 cm~2×440 s)。使用RT-qPCR和ELISA法评估M1巨噬细胞中脑源性神经营养因子(BDNF),神经生长因子(NGF),睫状神经营养因子(CNTF)和白血病抑制因子(LIF)的表达情况。使用Western Blot测定M1巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS),精氨酸酶1(Arg-1),蛋白激酶A(PKA),cAMP反应元件结合蛋白(CREB),磷酸化-cAMP反应元件结合蛋白(p-CREB),细胞外信号调节激酶(ERK)和磷酸化-细胞外信号调节激酶(p-ERK)的表达情况。通过构建移液共培养模型,在巨噬细胞条件培养基中培养背根神经节(DRG)神经元并评估DRG轴突生长情况。而后在使用PKA抑制剂H-89后,换液照射,并评估M1型巨噬细胞中p-CREB的表达水平和BDNF,NGF,CNTF和LIF的分泌情况,并在移液培养后测定DRG的轴突长度。结果:810-nm LLLT照射增加M1型巨噬细胞中BDNF,NGF,CNTF和LIF的分泌情况,降低M1巨噬细胞中iNOS的表达,上调Arg-1的表达,增加PKA和p-CREB的表达情况,并促进DRG轴突生长。PKA抑制剂H-89显著减少了LLLT诱导的M1巨噬细胞中神经营养因子的升高和p-CREB的表达,且移液后DRG轴突长度减少。结论:810-nm LLLT可下调M1巨噬细胞表达,上调M2巨噬细胞表达,LLLT通过PKA-CREB途径对M1巨噬细胞的神经营养因子分泌发挥促进作用,并增加神经元轴突生长。实验二:810-nm LLLT在DRG分泌CCL2影响巨噬细胞极化中的作用目的:研究LLLT对模拟脊髓损伤氧应激条件下DRG作用及其分泌改变对巨噬细胞极化状态的影响。方法:构建体外LLLT-DRG模型,对模拟SCI氧化应激条件下的神经元进行LLLT照射。照射参数如实验一。使用ROS试剂盒测定DRG中的ROS的含量,使用CCK-8法测定神经元的存活情况,并使用免疫荧光观察神经元轴突再生情况。通过RT-qPCR和ELISA,测定DRG的CCL2的表达情况。移液培养巨噬细胞后,使用RT-qPCR、Western Blot等技术分别测定巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS),精氨酸酶1(Arg-1)的表达情况。通过ELISA,测定TNF-α、IL-1β的表达情况。并在获得的经LLLT照射后的DRG条件培养基中加入CCL2的中和拮抗剂后,再移液培养巨噬细胞,观察其对巨噬细胞极化及分泌的影响。结果:研究证实810-nm LLLT可降低神经元内ROS的含量,提高氧应激条件下神经元的存活率,并促进神经元轴突再生。此外,810-nm LLLT可以促进氧应激条件下神经元在基因及蛋白等多层面CCL2的分泌表达。通过构建DRG上清液—M1型巨噬细胞过继培养模型,研究发现,810-nm LLLT干预后的DRG的上清液可以降低M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达情况及TNF-α、IL-1β的分泌情况,抑制M1型巨噬细胞的极化;同时,可以在基因水平上上调M2型巨噬细胞的标志物Arg-1。通过加入CCL2的中和抗体可以降低810-nm LLLT照射后的DRG条件培养基对巨噬细胞极化及分泌的影响。结论:810-nm LLLT可以促进SCI氧应激条件下DRG的存活及轴突再生,增加DRG CCL2的分泌水平,且这一改变可以减少巨噬细胞向M1方向极化,进一步说明了810-nm LLLT在巨噬细胞与神经元交互作用中具有促进作用。