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糖尿病(diabetes mellitus,DM)严重威胁人类健康,其并发症—糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR),是导致人类不可逆性盲的眼病之一。因此,如何对DR进行防治成为治疗糖尿病慢性并发症研究领域的一个重要课题。DR不仅仅是视网膜微血管病变,亦是神经退行性病变。研究发现,细胞凋亡参与DR神经组织损伤的重要过程。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)信号转导通路主要是由Akt、促凋亡因子Bad(bcl-2-associated death protein,Bad)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cysteine aspartic acid specific protease-9,Caspase-9)等一系列相关因子组成,在促进细胞生长、增殖、凋亡、分化和代谢等方面,通过激活Akt,使其磷酸化,进而磷酸化其下游一系列靶蛋白,从而发挥重要的生物学作用,尤其是它对细胞凋亡的调节作用。丝胶是一种蚕茧提取物,是由对人体极具营养价值的18种氨基酸组成的高分子水溶性蛋白。已有大量研究结果显示,丝胶可以有效降低2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠的血糖,并对糖尿病大鼠靶器官包括对糖尿病肾脏及中枢神经系统起到保护作用,但其对DR保护作用的研究还不是很多。本研究选用SPF级SD大鼠为研究对象,建立T2DM大鼠模型,探讨丝胶对T2DM大鼠视网膜神经细胞凋亡过程中PKB/Akt信号转导通路的影响,为治疗DR提供新方法。目的:通过观察丝胶对2型糖尿病大鼠视网膜神经细胞凋亡过程中蛋白激酶B(PKB/Akt)信号转导通路上的相关因子Akt、Bad和Caspase-9表达的变化,探讨丝胶对DR的保护作用及可能机制。方法:1以清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠为实验对象,共36只。按随机数字表法将大鼠进行完全随机化平均分组。正常对照组(NC组)不需要做任何处置,予普通饲料喂养;糖尿病模型组(DM组)、丝胶治疗组(ST组)予高热量饮食喂养,并采取腹腔注射STZ(25mg/kg/d),连续不间断注射3d,建立2型糖尿病大鼠模型,以空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG)值≥16.7mmol/L当作成模标准;模型建成后,ST组予丝胶(2.4g/kg/d,35d)灌胃,NC组、DM组予等量生理盐溶液灌胃,时间同为35d。2 ONE TOUCH血糖仪检测各组大鼠FBG情况。3 HE染色法观察各组大鼠视网膜病理改变。4 TUNEL法检测各组大鼠视网膜神经细胞的凋亡情况。5 Western blot法检测各组大鼠视网膜p-Akt、Bad、Caspase-9蛋白的表达。6 RT-PCR法检测各组大鼠视网膜p-Akt、Bad、Caspase-9 m RNA的表达。结果:1各组大鼠FBG情况:DM组大鼠FBG明显高于NC组(P<0.01),ST组FBG明显低于DM组(P<0.01)。2各组大鼠视网膜病理改变:NC组大鼠可见视网膜整体结构清楚,视网膜各层分层清晰,內界膜表面平滑无隆起,所有细胞形态正常,大小均匀,排列整齐;DM组大鼠视网膜整体结构欠清楚,內界膜表面明显肿胀,甚至有的部分出现断裂,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)有的呈空泡状改变,胞核固缩,细胞数量减少,排列稀疏紊乱;ST组大鼠视网膜內界膜呈轻度肿胀,细胞数量轻度减少、排列轻度紊乱。3 TUNEL法检测凋亡情况:阳性产物主要表现为胞核呈棕褐色、颗粒状,每组每张切片均可见。与NC组相比较,DM组及ST组凋亡细胞分布范围较大,阳性产物主要集中在RGCs层和内核层。AI结果:与NC组相比,DM组大鼠AI值明显升高(P<0.01);与DM组相比,ST组大鼠AI值明显降低(P<0.01),差异有统计学意义。4各组大鼠视网膜p-Akt的表达:免疫印迹法结果显示,p-Akt蛋白条带在蛋白Marker的56 KD处可见,β-actin蛋白条带位在蛋白Marker的43 KD处可见。RT-PCR结果显示,p-Akt m RNA条带在DNA Marker的271 bp水平处可见,β-actin m RNA条带在DNA Marker的452 bp水平处可见。p-Akt蛋白和m RNA表达在DM组大鼠视网膜中明显低于NC组大鼠(P<0.01)。在ST组大鼠视网膜中明显高于DM组大鼠(P<0.01)。5大鼠视网膜Bad的表达:免疫印迹法结果显示,Bad蛋白条带在蛋白Marker的18 KD处可见,β-actin蛋白条带在蛋白Marker的43 KD处可见。RT-PCR结果显示,Bad m RNA条带在DNA Marker的109 bp水平处可见,β-actin m RNA条带在DNA Marker的452 bp水平处可见。Bad蛋白和m RNA表达在DM组大鼠视网膜中明显高于NC组大鼠(P<0.01)。在ST组大鼠视网膜中明显低于DM组大鼠(P<0.01)。6大鼠视网膜Caspase-9的表达:免疫印迹法结果显示,Caspase-9蛋白条带在蛋白Marker的48 KD处可见,β-actin蛋白条带在蛋白Marker的43 KD处可见。RT-PCR结果显示,Caspase-9 m RNA条带在DNA Marker的247 bp水平处可见,β-actin m RNA条带在DNA Marker的452 bp水平处可见。Caspase-9蛋白和m RNA表达在DM组大鼠视网膜中明显高于NC组大鼠(P<0.01)。在ST组大鼠视网膜中明显低于DM组大鼠(P<0.01)。结论:丝胶可能通过调控PKB/Akt信号转导通路上相关因子的表达,即上调p-Akt及下调Bad、Caspase-9,发挥对DR的保护作用。