目的　　 H.pylori(Helicobacterpylori，Hpylori)是一种能够在人类的胃中成功定植的致病微生物，其长期定植可以引起多种胃部疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡，并有可能导致为肠化生、胃癌和粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤发生。H.pylori的感染率较高，约有50％的世界人口感染该菌，在我国H.pylori的感染率高达88.5％，而且一般为cagA阳性的高致病菌株，因此幽门螺杆菌感染所导致的疾病在我国更为普遍与严重，世界卫生组织认为幽门螺杆菌感染是导致胃癌的I型致病因子，而我国是胃癌高发国家。　　 宿主具有一系列的防御机制抵御H.pylori的感染，如胃蠕动、胃酸分泌、胃内复杂多变的环境以及宿主的免疫反应。然而，H.pylori能够在胃粘膜成功定植，这归因于其独特的生理结构，如分泌尿素酶。而且宿主免疫应答可以诱导幽门螺杆菌应激反应并表达抗氧应激的分子以及促进吞噬体内粗粒体的形成保护自身不被宿主清除。但是，过去的研究主要着眼于H.pylori如何逃避宿主的先天免疫应答，而其定植必然激活宿主的适应性免疫。过去的研究已经证实H.pylori对宿主树突状细胞(DCs)的成熟和功能有重要的影响，主要引起宿主Th1方向的细胞免疫反应，并且Th1细胞分泌的IFN-γ对于H.pylori的定植有重要的影响，H.pylori在正常小鼠体内的定植率明显低于IFN-γ-/-小鼠中的定植率，这说明IFN-γ在清除幽门螺杆菌定植方面具有重要作用。然而，H.pylori是如何逃避宿主的适应性免疫，特别是如何逃避IFN-γ清除作用研究不多。虽然之前的研究结果暗示IFN-γ与H.pylori之间有相互作用，但是他们之间如何作用尚不清楚。　　 H.pylori的膜中含有丰富的膜蛋白，有30多种，它们对离子运输、细菌粘附、渗透、结构稳定以及诱导信号转导有重要作用，而且有些膜蛋白具有的独特的免疫原性，还可以用来作为疫苗开发。根据对绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和土拉热弗朗西丝菌(Francisellanovicida)外膜蛋白的研究，我们通过生物信息学的方法锁定了本文所要研究的外膜蛋白-Hp1125，它和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)的OprF有较高的同源性，之前的研究发现，绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)膜蛋白与IFN-γ具有靶向结合作用。而H.pylori的Hp1125是否与IFN-γ也具有结合作用尚没有人研究。由于宿主的免疫反应不利于H.pylori的生存和定植，那么宿主免疫应答是否会诱导细菌的严谨应答反应，尤其是是否诱导调控严谨应答基因spoT表达，以及H.pylori的严谨应答反应是否参与调控其逃避IFN-γ所诱导的免疫应答尚不明确。　　 我们的研究主要探讨外膜蛋白Hp1125在H.pylori适应宿主IFN-γ中的机制，以及H.pylori的严谨应答反应在其中的作用，探究H.pylori逃逸宿主清除的机制，为临床预防和治疗提供线索。　　 方法　　 1、体外实验证实IFN-γ刺激可以引起H.pylori的严谨应答反应。在体外用一定浓度的IFN-γ刺激培养至对数期的幽门螺杆1h、2h、4h、8h之后，提取RNA并反转录为cDNA，进行Real-timePCR检测spoT的表达。　　 2、通过生物信息学的方法在H.pylori中查找绿脓杆菌膜(Pseudomonasaeruginosa)蛋白OprF的同源序列。我们在BLAST和BioCycdatabase中进行蛋白序列比对和查找。　　 3、通过同源重组的方法在HP26695菌株中构建Hp1125突变株。用pILL570质粒、pUC18K2质粒和PCR的方法构建敲除质粒。用验证正确的重组质粒电转野生株，筛选成功插入Kanal抗性基因的单克隆。　　 4、分析外膜蛋白Hp1125对H.pylori适应IFN-γ的影响。用IFN-γ分别处理HP26695和Hp1125突变株1h、2h、4h、8h后，提取RNA进行RT-PCR，然后进行Real-timePCR检测spoT的表达变化;分别提取野生株HP26695和Hp1125突变株的膜蛋白，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离，转到PVDF膜后用5％的BSA封闭，用IFN-γ作为一抗，anti-IFN-γ作二抗，然后用相应的二抗孵育，进行免疫荧光检查。　　 5、检测相关毒性基因的表达。IFN-γ处理野生株HP26695和Hp1125突变株后，通过WesternBlot检测了CagA和NapA的表达变化;然后分别检测了在8h点时，相关基因RNA水平上的变化，包括毒性相关的基因:cagA、vacA、napA、ureA和ureB;蛋白降解相关基因:clpX、clpP;细菌粘附相关基因:babA。　　 结果　　 1、用IFN-γ体外刺激H.pylori野生株后，和对照相比，其spoT的表达逐渐升高，在8h时差异最为显著，说明IFN-γ可以引起H.pylori的严谨应答反应。　　 2、生物信息学的分析发现，H.pylori的膜蛋白Hp1125与oprF具有较高的同源性。　　 3、在HP26695上成功构建了Hp1125的突变株。　　 4、用IFN-γ刺激Hp1125突变株发现spoT基因的表达与未用IFN-γ刺激时相似，没有显著的变化。提取的膜蛋白进行Westen-blot检查发现，IFN-γ只在野生株的蛋白泳道中有条带，敲除Hp1125的膜蛋白中未见有条带。　　 5、用WesternBlot检测IFN-γ刺激和未刺激HP26695和Hp1125突变株中不同时间点的CagA和NapA的表达，发现在用IFN-γ刺激野生株8h时，CagA和NapA表达均下降;而同样的处理在Hp1125突变株中未见到明显的变化。RNA水平上的检测同样证实了这一点。幽门螺杆菌其它毒力基因vacA、ureA、ureB、clpX、clpp和babA等在Hp1125突变株中mRNA表达水平均下调，暗示Hp1125的突变对H.pylori的致病、粘附都有要的影响。　　 结论　　 IFN-γ刺激H.pylori野生株时，spoT基因高表达，其毒性相关基因表达降低。当Hp1125不表达时，IFN-γ刺激后其spoT的表达与野生株中无差异，此时相关的毒性基因表达升高。结合我们之前的结果，spoT表达高时，毒性相关基因表达显著低于△spoT突变株。我们可以推测H.pylori可以通过Hp1125这个外膜蛋白识别并结合环境中IFN-γ-，激活自身严谨应答反应调控基因spoT，进而调节自身相关分子的表达，以适应外界环境的变化，达到逃避清除的目的。