目的:伴随着全球人口老龄化趋势日益加重,阿尔茨海默病这一以进行性认知功能障碍,行为异常,并逐步丧失生活自理能力为主要临床表现的神经系统退变性疾病的发病率也逐年增高,给家庭和社会带来了沉重的负担。临床研究发现,阿尔茨海默病患者更容易发生髋部骨密度下降及髋部骨折,使得治疗成本进一步提高。但这种骨质疏松改变是阿尔茨海默病本身的病理过程还是由于其神经功能缺失进而引发运动功能下降所带来的废用性骨质疏松目前还不得知。人体内骨量的维持依赖于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的动态平衡,而成骨细胞主要来源于其前体-骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞数量与成骨分化功能正常与否与骨质疏松的发生发展密切相关。由于阿尔茨海默病与骨质疏松都是多因素共同作用的疾病,这给阿尔茨海默病性骨质疏松的研究带来了一定的困难。Amyloidβ_1-42(Aβ_1-42)作为阿尔茨海默病特征性的病理产物,在阿尔茨海默病的发生发展过程中具有重要作用。我们前期基于阿尔茨海默病动物模型-APP/PS1转基因小鼠的研究表明,在其骨组织内存在过量表达的Aβ_1-42,同时其骨骼质量也明显下降,我们推测,这种骨量的过度流失与Aβ_1-42的存在可能有一定关系。同时有研究证实,Aβ_1-42能够增加破骨细胞的分化,强化其骨吸收功能。但Aβ_1-42对成骨效应,尤其是对骨髓间充质干细胞的影响尚未见报道,因此,本研究的主要目的是明确Aβ_1-42是否能够影响骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化能力,并探讨相关机制,为我们进一步认识阿尔茨海默病相关性骨质疏松提供更多的理论依据,同时为提出防治措施奠定一定的理论基础。研究方法:第一部分:我们以SD大鼠骨髓间充质干细胞为研究对象,分别利用CCK-8法检测BMSCs细胞活力、westen blotting法检测BMSCs细胞内核增殖蛋白PCNA表达、流式细胞术检测处于细胞周期S期的细胞所占比例及EdU染色法确定处于DNA合成期的细胞比例,来明确不同浓度Aβ_1-42作用48小时对BMSCs细胞增殖的影响。第二部分:在第一部分明确Aβ_1-42能够抑制BMSCs细胞增殖能力的基础上,我们利用流式细胞术检测了不同浓度Aβ_1-42作用48小时BMSCs细胞内的ROS水平,同时设置对照组,200μM/L H₂O₂组,5μM/L Aβ_1-42组及5μM/L Aβ_1-42+2.5mM/L N-AC组来验证ROS与BMSCs细胞增殖能力的关系。随后我们利用westen blotting,透射电子显微镜技术和免疫荧光技术检测Aβ_1-42作用48小时BMSCs细胞内自噬水平的变化,并在0h,4h,8h三个时间点利用westen blotting法及免疫荧光法确定ROS与自噬变化的先后关系。我们利用自噬激动剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA在5μM/L Aβ_1-42的基础上进一步激活及抑制BMSCs自噬水平,通过流式细胞术检测BMSCs细胞内ROS水平,CCK-8法检测细胞活力,westen blotting法检测PCNA蛋白表达及流式细胞术检测细胞周期S期细胞所占比例,评估自噬对BMSCs细胞ROS及细胞增殖的影响。200μM/L H₂O₂组,5μM/L Aβ_1-42组及5μM/L Aβ_1-42+2.5mM/L N-AC组,干预因素分别作用12小时后,利用westen blotting法检测AKT/mTOR通路关键蛋白AKT,p-AKT,mTOR,p-mTOR及相关自噬蛋白的变化,明确ROS调节自噬变化的分子机制。第三部分:保持BMSCs成骨及成脂分化间的平衡是防止骨质疏松发生的重要因素之一,本部分我们重点研究不同浓度Aβ_1-42对BMSCs成骨分化的影响,利用碱性磷酸酶检测试剂盒检测ALP活性,westen blotting法检测OCN,Runx2蛋白表达,茜素红染色检测钙结节形成能力来明确其对BMSCs成骨分化的影响。利用westen blotting法检测分化过程中Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin,GSK-3β,p-β-catenin的表达。在成骨分化变化最为明显的5μM/L Aβ_1-42的基础上,我们分别给予Wnt/β-catenin通路特异性激动剂BML-284和抑制剂JW74,再次检测成骨分化指标ALP活性,OCN,Runx2表达及钙结节形成能力以及Wnt/β-catenin通路关键蛋白表达,进一步明确Wnt/β-catenin通路在Aβ_1-42干预下BMSCs成骨分化中的作用。结果:第一部分:在我们设置的浓度范围内,使用Aβ_1-42干预骨髓间充质干细胞48小时后,BMSCs的细胞活力,PCNA蛋白表达,处于细胞周期S期细胞所占比例及EdU染色阳性细胞所占比例均随着Aβ_1-42浓度的升高而逐渐减少;第二部分:作用48h后的BMSCs细胞内ROS含量与Aβ_1-42浓度正相关,Aβ_1-42对BMSCs细胞增殖能力的抑制作用与经典氧化应激诱导剂H₂O₂相似,而使用抗氧化剂N-AC能够缓解Aβ_1-42引起的BMSCs增殖抑制。在48小时时间点,我们还发现BMSCs细胞自噬水平随着Aβ_1-42浓度的升高逐渐增加。进一步检测发现,ROS的改变先于细胞自噬的发生。自噬激动剂雷帕霉素能够在Aβ_1-42的基础上降低BMSCs细胞内ROS含量,缓解Aβ_1-42引起的BMSCs增殖抑制,而在Aβ_1-42的基础上使用3-MA抑制自噬,ROS含量进一步增多,且BMSCs的细胞增殖抑制现象更加明显。通过对经典自噬调节通路-AKT/mTOR信号通路的检测,我们发现12小时时,H₂O₂组和Aβ_1-42组的p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR比值明显高于N-AC拮抗组,westen blotting检测自噬相关蛋白的表达也表明自噬水平与ROS含量相关。第三部分:BMSCs成骨分化能力能随着Aβ_1-42浓度的升高逐渐受到抑制,同时Wnt/β-catenin通路也处于被抑制状态。当我们应用Wnt/β-catenin通路调节剂调控通路活性时发现,使用通路激动剂BML-284能够改善Aβ_1-42引起的成骨分化抑制,而通路抑制剂JW74能够加重Aβ_1-42引起的成骨分化抑制。结论:（1）Aβ_1-42能够通过上调BMSCs细胞内ROS水平抑制其增殖能力。（2）Aβ_1-42作用产生的ROS能够通过AKT/mTOR信号通路调控BMSCs自噬的发生,且Aβ_1-42作用下产生的自噬能够在一定程度上对抗其对BMSCs增殖功能的抑制。（3）Aβ_1-42能够通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs成骨分化功能。