中药复方制剂由于多组分产生的多靶点生物效应特点使其生物有效性难以评价,剂型设计与技术应用更难以进行,建立与中药制剂效应相关的可量化的生物有效性综合评价体系及合适的制剂学技术应用不仅是中药制剂基本科学问题,更是中药现代化研究的关键。中药制剂生物有效性综合评价体系的建立及制剂学应用存在以下技术瓶颈：①以网络效应形式表达的中药制剂功效所对应的多组分活性成分及其构效与量效关系的复杂性使得与中药制剂生物有效性表达相关的活性成分群难以辨识；②中药制剂多组分体内过程及其相互影响规律难以阐明,综合体系难以构建；③中药活性成分群及伴生物质群理化性质的复杂性使得中药制剂剂型设计、技术选择陷入困窘。如何运用合适的手段快速、正确的辨识活性成分群,打破中药制剂过程质量控制标准不完善的技术瓶颈?如何表征中药制剂生物药剂学的综合评价体系,打破中药制剂剂型改革与技术应用量化标准不完善的技术瓶颈?针对活性成分群整合药代动力学-Integrated AUC氏,如何选择适合的药剂学技术提高Integrated AUC?等等关键问题均有待进一步研究。因此,本课题以生物药剂学与药代动力学为基础,选择临床配伍最小单位“药对”—“银翘”为研究对象。作者针对活性成分群难以辨识,创新性地提出’Drug-drug interaction结合ΣK-PD相关性辨识‘银翘,药对主要活性成分”及“‘生物效应放大,佐证‘银翘,药对中金银花、连翘主要活性成分”等思路来辨识、佐证“银翘”药对主要活性成分,通过“‘抗病毒效价-IC50’分析研究‘银翘’药对整合药代动力学-Integrated AUC的思路来评价“银翘”药对生物有效性,针对中药制剂剂型设计、技术选择等瓶颈,作者选择简单的药剂学手段—吸收促进剂技术,并通过‘"Integrated AUC研究调控市售‘银翘’制剂抗病毒生物活性”的思路成功应用于市售四种制剂(双黄连口服液、银翘解毒片、复方芩兰口服液、清热解毒口服液),显著提高了制剂的抗病毒疗效。UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS结合UPLC-ESI-MS/MS定性、定量“银翘”药对体内外化学成分的研究结果表明,利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS,共检测体外化合物35种,包括了酚酸类7种(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸、咖啡酸),苯乙醇苷5种(异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷D、连翘酯苷E),黄酮类7种(芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷、紫云英苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),异黄酮类2种(染料木苷、染料木素),木脂素类9种(牛蒡子苷、连翘苷、松脂素-β-D-glucoside、牛蒡子苷元、松脂素、连翘脂素、表松脂酚、表松脂酚-β-D-glucoside、松脂素单甲基醚),皂苷类2种(灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙),环烯醚萜类3种(马钱苷、当药苷、Centauroside)。纵观国内外文献及现有对照品信息,创新性的开发了一种UPLC-ESI-MS/MS同时快速定量“银翘”药对26种指标性成分的方法。并利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析了“银翘”药对血中“移行成分”,结合体外分析结果,共检测体内化学成分32种,其中包括29种原形化合物,分别为酚酸类7种(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸、咖啡酸),苯乙醇苷5种(异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷D、连翘酯苷E),黄酮类7种(芦丁异槲皮苷、金丝桃苷、紫云英苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),异黄酮类2种(染料木苷、染料木素),木脂素类7种(连翘苷、松脂素-β-D-glucoside、牛蒡子苷元、松脂素、连翘脂素、表松脂酚、表松脂酚-β-D-glucoside),环烯醚萜类1种(马钱苷)。且通过MetWorks软件及文献的比对,发现3种代谢产物,根据其质谱裂解规律,分别为A1#(松脂酚-o-glucuronide),A2#(表松脂酚-o-glucuronide),A3#(连翘脂素-o-glucuronide)。基于“入血物质才可能为活性成分”,以上29种化合物可作为体内研究对象,并作为指标性成分来代表“银翘”药对,但限于现有对照品缘故,且①松脂素、连翘脂素、表松脂酚在“银翘”提取液中含量甚低；②表松脂酚-β-D-glucoside、松脂素-β-D-glucoside虽为同分异构体,质谱显示其具有相同的裂解规律(相同的母离子、子离子),但UPLC-ESI-MS/MS分析“银翘”药对药代动力学时,发现血中只检测到松脂素-β-D-glucoside,并未见表松脂酚-β-D-glucoside;(③具有类似母核的化合物具有相同的吸收机制,如：苯乙醇苷类,通过研究异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B来推测连翘酯苷D、连翘酯苷E具有一定的科学性。因此,基于以上分析,我们选择29种指标性成分中23种,即：酚酸类7种(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、奎宁酸、咖啡酸),苯乙醇苷3种(异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B),黄酮类7种(芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷、紫云英苷、木犀草苷、槲皮素、木犀草素),异黄酮类2种(染料木苷、染料木素),木脂素类3种(连翘苷、松脂素-β-D-glucoside、牛蒡子苷元),环烯醚萜类1种(马钱苷)作为“银翘”药对体内研究对象。Drug-drug interaction(DDI)结合ΣPK-PD相关性辨识“银翘”药对主要活性成分的研究结果表明,利用体外化学成分DDI、肠吸收屏障DDI结合体内生物活性成分DDI三种模型共同辨识了“银翘”药对配伍前后变化,并通过HCA结合PCA手段确定了异连翘酯苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷A为影响“银翘”药对配伍的活性成分群(Chemical markers),且通过PLS分析了标志性成分的PK(∑PK)与抗病毒PD的相关性进一步确定了咖啡酰衍生物：3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、异连翘酯苷、连翘酯苷B、连翘酯苷A为抗病毒主要的Chemical markers。“生物效应放大”佐证“银翘”药对中金银花、连翘主要活性成分的研究结果表明,咖啡酰衍生物肠吸收机制均为被动转运,且主要受细胞旁路影响。新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4-二咖啡酰奎宁酸可能为P-gp、MRP2及BCRP的共同底物,而异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B可能为P-gp和MRP2的共同底物。通过比较金银花、连翘提取液与咖啡酰衍生物单体吸收特征,发现金银花提取液中酚酸类外排小于单体,但连翘提取液中苯乙醇苷类外排大于单体。但由于吸收均较差,且外排率(Efflux ration)小于1,判别其吸收屏障与单体类似亦为紧密连接。采用壳寡糖技术提高了金银花、连翘提取液中咖啡酰衍生物生物利用度,发现其抗病毒效果大大提高,则从侧面佐证了金银花、连翘提取液中Chemical markers,即通过提高所为Chemical markers体内暴露,是否可提高疗效?反证Chemical markers选择的合理性。“抗病毒效价-IC50"分析研究“银翘”药对咖啡酰衍生物整合药代动力学-IntegratedAUC的研究结果表明,咖啡酰衍生物体外抗病毒活性顺序为：连翘酯苷A>连翘酯苷B>3,4-二咖啡酰奎宁酸≈异连翘酯苷>3,5-二咖啡酰奎宁酸>新绿原酸>绿原酸>隐绿原酸。然而,异连翘酯苷、连翘酯苷A、连翘酯苷B体内暴露水平却远远低于绿原酸。作者通过连翘酯苷A“敲入”“银翘”药对后进行整合药代动力学研究表明,尽管抗病毒效价AUE显著提高了,但“曲线下面积(AUCO-w)”设置权重系数的Integrated AUC却无显著性影响,而“抗病毒效价-IC50"设置权重系数的Integrated AUC显著增加。通过“效价-IC50"设置权重系数得咖啡酰衍生物整合药代动力学曲线,DAS2.1.1分析药代动力学参数,发现T1/2、AUC、 Cmax、MRT充分兼顾了各个咖啡酰衍生物的药代动力学特征,且整合药代动力学曲线与抗病毒效应具有良好的关联性,表明了在某种条件下,“曲线下面积(AUCOw)"设置权重系数只具备数学意义,忽略了成分之间效应的贡献,而“抗病毒效价-IC50"设置权重系数更具科学性。"Integrated AUC"研究调控市售“银翘,,制剂抗病毒生物活性的研究结果表明,“银翘”药对肠吸收屏障位于紧密连接。并通过以下三点标准筛选“银翘”药对制剂,即：①具有相同组成的“银翘”化学成分；②“银翘”药对在制剂中作为主要药物组成；③具有与“银翘”,药对类似的肠吸收屏障。结果发现四种市售制剂(双黄连口服液、清热解毒口服液、复方芩兰口服液、银翘解毒片)符合标准。通过研究壳寡糖对市售“银翘”制剂Integrated AUC及抗病毒活性的影响,发现壳寡糖自身不具备抗病毒活性,且不能促进“敲除”“银翘”药对的“银翘”制剂抗病毒活性,但可提高“银翘”药对制剂的病毒抑制率,说明了壳寡糖提高“银翘”制剂抗病毒活性的确是提高了“银翘”药对体内暴露水平,且发现“银翘”药对中各咖啡酰衍生物生物利用度及Integrated AUC亦不同程度的提高,从侧面证明了咖啡酰衍生物确实为“银翘”药对Chemical markers,控制着“银翘”药对的抗病毒疗效,亦证明了“‘抗病毒效价-IC50’分析研究‘银翘’药对咖啡酰衍生物整合药代动力学-Integrated AUC思路的合理性,并成功利用吸收促进剂-壳寡糖对“银翘”药对制剂进行了二次开发。本文采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS结合UPLC-ESI-MS/MS定性、定量“银翘”药对体内外化学成分,通过Drug-drug interaction结合ΣPK-PD相关性辨识“银翘”药对主要活性成分,进而应用“生物效应放大”佐证“银翘”药对中金银花、连翘主要活性成分,并根据“抗病毒效价-IC50”分析研究“银翘”药对咖啡酰衍生物整合药代动力学-IntegratedAUC”,以"Integrated AUC"研究调控市售“银翘”制剂抗病毒生物活性。研究思路与方法对中药制剂生物药剂学开展具有一定指导意义。