研究背景：目前，脊髓损伤后治疗依然存在重重困难，主要是神经组织自身修复能力有限。据文献报道，胚胎干细胞和神经干细胞可以作为种子细胞修复神经组织，然而其来源有限，并且其获取受伦理道德的制约。近年来，具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于易于获取而被广泛应用于细胞移植损伤修复，但是脊髓损伤区营养因子分泌缺乏、诱导环境条件不足，导致修复效果不理想。因此，保持MSCs的长期存活、提高其向神经元细胞分化率非常重要。wnt家族在肿瘤、肌肉再生、神经系统修复、生殖系统、肢干背腹形成和后肢发育、软骨与眼角膜修复、心脏发育方面均发挥重要作用。Wnt7a是wnt家族的重要成员之一。研究证明，更新的卫星干细胞中wnt7a表达上调，Wnt7a能够刺激卫星干细胞的对称延伸，促进卫星细胞和卫星干细胞的增殖。在创伤角膜中，Lyu J等[1]发现Wnt7a表达能够迅速被诱导，并启动角膜上皮细胞的增殖，从而增强创伤愈合。同时，wnt7a在神经发展、轴突和突触生长中发挥着重要作用。Ciani和其他学者[2-4]初步研究发现Wnt7a能够诱导轴突延伸和分支,对促进神经前体细胞向神经元方向分化有重要作用。因此，我们推断Wnt7a在组织修复中可能具有重要作用。研究目的：1.构建Wnt7a腺病毒表达载体转染MSCs，研究Wnt7a过表达对MSCs增殖的影响及机制。2.研究Wnt7a过表达对MSCs向神经元样细胞分化的影响，以期为临床应用MSCs治疗脊髓损伤提供初步的实验基础。研究方法：1.采用密度梯度离心法并联合贴壁培养进行SD大鼠骨髓间充质干细胞分离、纯化，流式细胞仪检测细胞表面标记分子，通过成骨诱导分化进行鉴定。2.通过PCR方法克隆Wnt7a基因，通过同源重组构建腺病毒表达质粒，通过PCR进行阳性克隆鉴定，并通过测序鉴定筛选出的阳性克隆，利用Western blot检测Wnt7a基因表达。在大肠杆菌中扩增阳性克隆质粒和腺病毒辅助质粒，然后在293T细胞中进行同源重组进行病毒包装。通过CsCl密度梯度离心进行病毒的纯化，然后通过试剂测定病毒的滴度。3.将大鼠骨髓间充干细胞培养于96孔板，按MOI=60、80、100进行腺病毒感染预实验。4.将MSCs细胞铺到24孔板，16h后按MOI=80感染Wnt7a腺病毒和对照腺病毒，感染后观察荧光情况，利用MTT实验检测细胞的增殖情况。5. Western blot检测Wnt7a表达腺病毒感染MSCs后Wnt7a、β-catenin和CyclinD1的表达。6. MSCs细胞向神经元样细胞诱导，将实验细胞分成3组：MSCs组、MSCs+对照病毒组、MSCs+Wnt7a腺病毒组，每孔加入1mL DMEM/低糖+10ng/mL bFGF培养过夜，换液后每孔加入1mL DMEM/低糖+200μmol/L BHA液，诱导5h，吸走诱导液，加入300μL/孔的4%多聚甲醛固定25min，免疫荧光检测MSCs细胞向神经元样细胞诱导后NSE蛋白表达。结果：1. MSCs细胞生长状态良好，贴壁生长，呈长梭形；细胞表面CD34、CD45阴性表达，CD44、CD90阳性表达。成骨诱导后碱性磷酸酶染色见钙颗粒。2.通过PCR方法克隆Wnt7a基因获得1085bp片段，与NCBI gene bank中片段大小基本相符。通过PCR阳性克隆鉴定和测序证明构建的腺病毒表达质粒完全正确。Western blot检测Wnt7a表达质粒转染293T细胞后的表达，在72KD处有阳性条带，其大小和Wnt7a-GFP-Flag融合蛋白（69KD）相吻合。通过试剂盒测定对照腺病毒的滴度是7.8×1010vp/mL，Wnt7a过表达病毒的滴度是1.3×1010vp/mL。3.荧光显微镜下观察发现构建的对照腺病毒在MOI=80时感染效果最好，Wnt7a过表达病毒在MOI=100时感染效果最好。4. MTT实验结果显示，在第1、2天，MSCs+Wnt7a腺病毒组细胞OD(570)值与MSCs+对照腺病毒组细胞、MSCs组细胞相比均没有差异，MSCs+对照腺病毒组细胞和MSCs组细胞相比也没有差异。在第3、4天，MSCs+Wnt7a腺病毒组细胞D(570)值与MSCs+对照腺病毒组细胞、MSCs组细胞相比均有差异（P<0.05）。在第5天，MSCs+Wnt7a腺病毒组细胞D(570)值与MSCs+对照腺病毒组细胞、MSCs组细胞相比均有差异（P<0.01）。说明，在第1、2天，MSCs感染Wnt7a腺病毒组细胞增殖速度与感染对照腺病毒组细胞、MSCs组细胞没有明显差异；在第3～5天，MSCs感染Wnt7a腺病毒组细胞增殖速度与感染对照腺病毒组细胞、MSC组细胞有明显差异。5. Wnt7a腺病毒感染大鼠MSCs后，CyclinD1蛋白、细胞质中β-catenin蛋白和细胞核中β-catenin蛋白表达与感染对照病毒的MSCs组相比分别增加2.1、1.5、1.7倍，均有显著差异（P<0.05)；感染对照病毒的MSCs与单纯的MSCs相比上述蛋白的表达没有差异（P＞0.05）。6. MSCs细胞向神经元样细胞诱导，将实验细胞分成3组：MSCs组、MSCs+对照病毒组、MSCs+Wnt7a腺病毒组，3组细胞经过诱导后均可见神经元标记蛋白NSE的表达（图8），但是3组的诱导分化率不同，单纯的MSCs组细胞向神经元样细胞诱导率在45%左右，感染对照腺病毒MSCs细胞向神经元样细胞诱导率在40%左右，感染Wnt7a腺病毒MSCs组细胞向神经元样细胞诱导率在67%左右。感染Wnt7a腺病毒MSCs组细胞与感染对照腺病毒MSCs细胞相比存在明显差异（P<0.05），感染对照组腺病毒MSCs细胞与纯MSCs组细胞相比没有差异（P＞0.05）。结论：1.通过密度梯度离心贴壁培养法成功的培养出大鼠MSCs细胞，且细胞增殖良好，此方法操作简单；通过CD34、CD45阴性表达，CD44、CD90阳性表达和成骨诱导后碱性磷酸酶染色见钙颗粒可以判定获得的细胞为MSCs。2.通过PCR阳性克隆鉴定、测序、Western blot及滴度鉴定实验证明腺病毒构建成功。3.对照腺病毒在MOI=80时感染效果最好，Wnt7a过表达病毒在MOI=100时感染效果最好，后续实验按照此MOI值进行。4. Wnt7a对大鼠MSCs有明显的促进作用。5. Wnt7a蛋白过表达后提高CyclinD1蛋白、细胞质中β-catenin蛋白和细胞核中β-catenin蛋白表达，可能激活了经典的Wnt/β-catenin通路。6. Wnt7a蛋白过表达后提高MSCs细胞向神经元样细胞诱导效率。为后期作为种子细胞进行动物脊髓损伤修复实验提供了理论基础。