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扁形动物是在动物演化进程中是首次出现两侧对称、三胚层的类群,而东亚三角涡虫(Dujesia japonica)是扁形动物门涡虫纲的代表动物,且涡虫具有很强的再生能力,因而其已成为研究进化,发育和再生机制的模式动物。 目前,已在从低等到高等如线虫、果蝇、斑马鱼、鼠、人等的多种生物体内中发现了TRAF3基因的存在,在哺乳动物中TRAF3广泛分布于体内的各个组织,例如心、脾、肺、肝脏和肠等,与TNFR和TLRs结合参与生物体的免疫,影响细胞的生存、增殖、分化和死亡。目前已知,TRAF3可以与TBK-1结合诱导产生IFN,参与Toll样受体信号通路;还可以通过对NIK的负调控来已知NF-κB信号通路,此外还发现它在非TLRs信号通路依赖型的抗病毒过程中也扮演重要角色。 从本实验室 cDNA文库中得到一编码为12118-283的基因,序列全长746bp,其最大开放阅读框为564bp,编码的蛋白质含187个氨基酸,蛋白分子量大小约为21.3KDa。蛋白序列经 NCBI的 BLAST比对发现该蛋白包含一个 MATH( meprin and TRAF-C homology) superfamily结构域也即 TRAF结构域,预测其底物结合区位于98-159位氨基酸区域内,与其他动物类群的TRAF3氨基酸序列比对发现,该蛋白与果蝇相似度约23％,与斑马鱼相似度约36%,与哺乳动物相似度高达35-39%,对各物种的TRAF3蛋白序列中TRAF结构域进行比对,结果显示 TRAF3蛋白中的 TRAF结构域具有高度保守性。此外进化分析结果表明,DjTRAF3和果蝇的 TRAF3聚群,位于进化树的基部,属于较原始类型。 通过 Northern杂交,确定 DjTRAF3基因存在于东亚三角涡虫中,并检测了其大小。杂交结果显示有一大小750bp左右的信号带,大小与已有 cDNA吻合。通过原位杂交的方法得出结果:无论在涡虫整体还是在再生各个时期, DjTRAF3基因的阳性信号一致出现在整个肠上。同时,整体原位切片结果显示:DjTRAF3基因的阳性信号也在整个肠上,推测该基因参与涡虫的免疫过程。利用 LPS诱导涡虫,并对诱导不同时间段的涡虫进行 Real-time PCR检测, Real-time PCR结果显示,LPS诱导后 DjTRAF3基因的表达量出现明显起伏,表明涡虫 DjTRAF3基因参与了涡虫免疫过程的调控。 构建 PET28a-DjTRAF3及 pGEX-DjTRAF3原核表达载体,通过 IPTG普通诱导和自诱导两种体系对融合蛋白诱导表达,并进行 western blotting鉴定及纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,两者均表达出一大小约为21kDa的条带,经Western blotting鉴定证实表达出的确为 DjTRAF3蛋白,但 PET28a-DjTRAF3重组载体表达量更高,表达操作亦更简便,因而进一步用 PET28a-DjTRAF3大量表达,并利用得到的蛋白进行抑菌实验,结果显示 DjTRAF3蛋白有一定程度的抑菌作用。