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【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是近十几年来研究最广泛、最明确的一类大小约22nt、内源性的小非编码RNA分子。其经典的作用机制是成熟的miRNA组装进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),种子序列依据与靶基因mRNA非翻译区的配对程度决定mRNA降解还是翻译抑制,从而在转录后水平调节基因的表达。但是,最近的研究发现,miRNA还可以在转录和转录后水平上调基因的表达,这依赖于miRNA与靶mRNA序列的特异性相互作用,并且与miRNA核糖核蛋白复合体(microribonucleoprotein,microRNP)的具体成分及细胞的功能状态密切相关。另外,miRNA参与的调控网络是复杂的,既可以通过一个miRNA调控多个靶基因的表达,也可以通过几个miRNA的组合精细调控一个靶基因的表达。本实验室前期工作发现,在宫颈癌细胞中,miR-138靶定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA 3’UTR并负性调控其表达,抑制细胞的生长;miR-346靶定并上调hTERT的表达,促进细胞的生长,并且miR-138和mi R-346靶定hTERT mRNA 3’UTR的同一区域,二者竞争调控hTERT mRNA,维持其异常高表达水平。本课题在此基础上着重阐明miR-346结合hTERT mRNA 3’UTR上调其表达的分子机制。【方法】首先,宫颈癌细胞HeLa经放线菌素D(actinomycin D,Act D)处理之后用定量PCR(qRT-PCR)实验检测hTERT mRNA的表达水平,确定miR-346在转录水平还是转录后水平调控hTERT mRNA的表达。然后,用RNAhybrid软件预测miR-346/hTERT mRNA二聚体的可能二级结构,深入分析miR-346的模序;生物信息学预测miR-346的其它候选靶基因,并预测与这些候选靶基因形成二聚体后miR-346暴露的模序结构,分别选取与mi R-346杂交后暴露和不暴露类似miR-346/hTERT mRNA中miR-346模序的两个靶基因。利用荧光报告载体实验、qRT-PCR和western blot实验分别研究miR-346对hTERT的调控是否受AGO2的影响、模序突变型miR-346对hTERT表达调控的影响以及miR-346对ACVR2B表达调控的影响。在HeLa细胞中用AGO2的抗体进行RNA免疫沉淀实验(RNA IP,RIP),qRT-PCR检测AGO2复合体中miR-346和hTERT mRNA的富集水平。同时,利用MTT实验和平板克隆形成实验检测模序突变型miR-346对细胞活性和生长能力的影响。之后,将mi R-138/hTERT mRNA二级结构中暴露出的“UGAA”模序突变为野生型mir-346的“ccgcau”模序或突变型“aaaaua”模序,westernblot实验检测突变型mir-138对htert蛋白表达的影响。接下来,在hela细胞中单独改变grsf1或同时改变grsf1和野生型或模序突变型mir-346的表达水平,westernblot实验检测htert蛋白或acvr2b蛋白表达水平的改变,从而分析grsf1在mir-346上调htert和acvr2b表达过程中的作用。随后,利用rip实验和rna凝胶电泳迁移实验(electrophoreticmobilityshiftassay,emsa)实验验证grsf1与mir-346和/或htertmrna的相互作用。进一步地,用蔗糖密度梯度离心实验分离和纯化核糖体,qrt-pcr检测核糖体组分中mir-346和htertmrna的富集程度,分析mir-346是否募集htertmrna到核糖体以及该过程是否由grsf1介导。【结果】mir-346延长htertmrna的半衰期,增强htertmrna的稳定性。敲降ago2不影响mir-346对含有htert3’utr的绿色荧光蛋白报告基因和内源性htertmrna和蛋白的表达调控。ago2复合体中htertmrna的富集水平与mir-138(阳性对照)的表达水平呈正相关关系,与mir-346的表达水平呈负相关关系。rnahybrid软件预测mir-346/htertmrna二聚体的可能二级结构,二者杂交后mir-346暴露出“ccgcau”模序。突变mir-346的模序序列取消了野生型mir-346对报告基因和内源性htert表达的促进作用,解除了mir-346对细胞生长和增殖的促进作用。另外,含有mir-346“ccgcau”模序的mir-138促进htert蛋白的表达,而含有mir-346突变型“aaaaua”模序的mir-138抑制htert蛋白的表达。同时,生物信息学预测发现mir-346的候选靶基因有142个,rnahybrid软件分析mir-346与候选靶基因杂交的可能二级结构,最终选取了其中两个靶基因—activinareceptor,typeiib(acvr2b)和smadfamilymember3(smad3),其中,mir-346/acvr2bmrna二聚体暴露出mir-346的“ccgcau”模序,而mir-346/smad3mrna二聚体则不暴露类似的模序结构。mir-346靶定acvr2b3’utr并上调其的表达,同时,mir-346靶定smad33’utr并负性调控其表达。模序突变型mir-346解除了野生型mir-346对acvr2b的上调作用但不影响野生型mir-346对smad3的调控。htert蛋白和acvr2b蛋白的表达水平与grsf1水平呈正相关关系;敲降grsf1,mir-346上调htert和acvr2b表达的能力减弱,含有mir-346“ccgcau”模序的mir-138上调htert表达的能力减弱;突变mir-346的模序,grsf1促进htert和acvr2b表达的能力减弱。mir-346和hTERT mRNA在GRSF1复合体中富集,而且GRSF1复合体中hTERT mRNA的富集程度与miR-346的表达水平呈正相关关系。mi R-346和miR-346/hTERT mRNA3’UTR与GRSF1蛋白直接相互作用;miR-346模序突变后,该相互作用不存在。进一步分析发现,miR-346和hTERT mRNA在核糖体组分中共分布;而且,miR-346促进hTERT mRNA募集到核糖体,使其在核糖体组分中富集增加,分布曲线右移;突变miR-346的模序,hTERT mRNA在核糖体组分中富集减少,hTERT mRNA分布曲线左移。敲降GRSF1,miR-346介导的hTERT mRNA在核糖体组分中富集减少;模序突变型miR-346削弱了GRSF1介导的野生型mi R-346对hTERT mRNA到核糖体的募集。【结论】在宫颈癌细胞中,GRSF1以依赖miR-346“CCGCAU”模序的方式介导miR-346募集hTERT mRNA到核糖体并促进其翻译,该过程不依赖AGO2。