嗜盐放线菌YIM 96748基因簇表达初步研究

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拟无枝酸菌是是一类极具应用前景的微生物资源,能产生的大量具有生物活性次生代谢产物。目前已从拟无枝酸菌挖掘出利福霉素、万古霉素、巴里霉素、氯霉素、替拉万星、奥利万星、Dethymicin等多种重要的抗生素,为人类健康作出了巨大的贡献。随着抗生素的广泛使用,病原微生物进化出复杂抗生素耐受机制,耐药性病原微生物不断出现,对全球人类健康构成了严重威胁。开发新的抗生素,尤其是具有新作用方式的抗生素,是避免未来耐药性病原微生物灾难性流行的必要要素之一。嗜盐放线菌是一类能都耐受高盐环境的微生物。它们需要产生相应的生理机制为了适应高盐环境,在适应环境的过程中可能会产生与其他放线菌物种不同的次级代谢产物。通过对嗜盐放线菌进行研究,可能发现新型具有活性的代谢产物,从而开发出新作用方式的抗生素。实验菌株YIM 96748由从新疆盐湖采集的土样分离出。首先对菌株的生长条件进行研究。通过16S r RNA系统发育树、全基因组系统发育树、YIM 96748与参考菌株Amycolatopsis cihanbeyliensis BNT52T的ANI值(88.97%)和DNA-DNA值(59.60%)分析,表明YIM 96748分类学地位为拟无枝酸菌属潜在新物种。YIM96748基因组数据通过综合运用anti SMASH、NP.searcher、PRISM 3,Deep BGC、clusterfinder、ARTS等基因组挖掘工具,发现其具有数量丰富、潜在功能多样的基因簇32个,具有产生多种新型活性化合物的潜在能力。首先,对菌株YIM 96748基因簇进行传统发酵研究。经过培养基筛选,采用1#培养基进行发酵得到4.16g粗提物,从中分离得到2个已知化合物,分别为4-Methoxyphenylacetic acid和Ergosterol endoperoxide。实验结果表明,嗜盐放线菌YIM 96748采用传统发酵,功能基因簇表达量极少或不表达,需要进行新的尝试,因此,我们对其进行了异源表达的初步探索。为了克隆潜力基因簇,首先构建了含有1800个克隆子的YIM 96748基因组文库。在对基因组文库进行克隆片段多样性测序检测过程中获得了包含18号基因簇完整片段的克隆子,该基因簇具有合成新类型萜类化合物的潜力,将其作为目标基因簇进行异源表达的探索。通过接合转移成功将18号基因簇导入了链霉菌模式菌株Streptomyces albus J1074,构建了异源表达工程菌株。采用10种培养基对工程菌株进行初步发酵探索,从中选择A3培养基进行扩大发酵,获取目的基因簇的代谢产物。目前已得到5个可能含有18号基因簇表达产物的样品。通过本次对YIM 96748基因簇表达研究表明,嗜盐放线菌采用异源表达方法获取功能基因簇表达产物具有可行性。对后续实验室嗜盐防线菌资源挖掘有重要的指导意义。
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