论文部分内容阅读
N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)是一种存在于许多哺乳动物中的唾液酸(sialic acid,Sia),尤其是存在于后口动物的糖复合物中。但在人类和鸡体内是无法合成,只能通过食用红肉和牛奶这种富含Neu5Gc的食物,才能进入人类身体组织中。Neu5Gc一旦进入人体,就会被吸收到细胞膜上。它是某些致病微生物的特异性受体,如大肠杆菌K99就会特异地结合肠细胞上的Neu5Gc,从而引发疾病,导致人类严重的食物中毒和其他症状。Neu5Gc通过食源进入人体后可以产生异种抗体,Neu5Gc和其抗体相互作用产生炎症反应,可以促进肿瘤和相关疾病的发生和发展。研究表明肿瘤组织中含有大量的Neu5Gc,远远超过正常人类健康组织。通过食用含有Neu5Gc的食物而进入人体内的Neu5Gc与人类某些肿瘤的发生发展有关,可以作为某些肿瘤的特异性标志物,而且抗Neu5Gc抗体在体内可以促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤性作用,因此Neu5Gc成为了食品安全检测与肿瘤诊断的新靶标。然而,由于检测方法的局限性,关于其发生机理和生物学功能的研究相对较少,而建立一种快速、灵敏、实用的红肉、牛奶和肿瘤细胞中Neu5Gc的检测方法尤为必要。目前,用于Neu5Gc检测的方法主要是化学仪器方法和免疫学方法。但这些方法都有一些缺点和不足,例如化学仪器法费用昂贵,使用前样品处理复杂,需要专业人员操作等;免疫学方法目前无法检测游离态的Neu5Gc,因此,目前急切需要建立一种快速,简便,灵敏,可同时检测结合态与游离态的Neu5Gc的方法。免疫学检测方法有适合此种要求的潜质,而免疫学检测方法的建立首先需要制备高效价和强特异性的抗体。为了制备高效价和强特异性的抗Neu5Gc抗体,本实验首先采用碳二亚胺法对Neu5Gc与匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,制备人工完全抗原。通过紫外扫描和琼脂糖凝胶电泳对偶联物进行验证分析,初步验证Neu5Gc人工完全抗原制备成功。通过对20周龄的海兰褐蛋鸡的免疫,取得了良好的效价和竞争效果,卵黄抗体(Ig Y)效价达1:10000,确定Neu5Gc人工完全抗原制备成功,试验制备的完全抗原以及经免疫的海兰褐蛋鸡可用于下一步试验。然后运用分子生物学方法和基因工程技术提取免疫鸡脾脏总RNA,反转录成c DNA,以此为模板,PCR扩增出免疫鸡重、轻链可变区基因,再通过Linker和重叠延伸PCR(SOEPCR)体外合成单链抗体(sc Fv)基因,将单链抗体基因克隆到噬菌体质粒载体(p CANTAB5E)上,并通过氯化钙转化法将重组噬菌粒转化入大肠杆菌TG1中构建了一个库容量为1.7×107 cfu/m L抗Neu5Gc的鸡源单链抗体基因初级文库,随后利用噬菌体展示技术对初级文库进行四轮的吸附、洗脱、扩增、富集和淘选并通过噬菌体ELISA(Phage ELISA)对其定性、定量和测序分析,得到与Neu5Gc具有高亲和力的命名为AKsc Fvj1、AKsc Fvj2、AKsc Fvj3和AKsc Fvj4的4株噬菌体展示单链抗体菌株。最后成功的人工表达了单链抗体AKsc Fvj3和AKsc Fvj4。通过间接竞争ELISA建立单链抗体AKsc Fvj4竞争抑制曲线,抗原Neu5Gc-BSA最佳工作浓度为4μg/m L,sc Fv最佳稀释为1:1600,sc Fv抗体效价为1:3200,竞争抑制效果较好,IC50为5.333μg/m L,线性范围为0.66~286.42μg/m L,检测灵敏度为0.66μg/m L,竞争抑制曲线线性回归方程为:y=23.12x+33.19,线性系数为R=0.980。抗Neu5Gc鸡源单链抗体的获得为下一步Neu5Gc免疫学检测方法的建立奠定了基础,继而为检测红肉和牛奶及人类肿瘤组织中的游离态与结合态的Neu5Gc提供了新的思路。