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第一部分新西兰大白兔下甲状旁腺血管解剖研究[目 的]解剖并描述新西兰大白兔下甲状旁腺位置及血管特点。[方 法]手术探查新西兰大白兔下甲状旁腺及其血管情况。[结 果]1新西兰大白兔下甲状旁腺位置分型:A型为紧密型,B型为疏离型。其中B型以甲状腺水平区域为界,可分为3型,分别为:B1型(甲状旁腺位于甲状腺上极以上);B2型(甲状旁腺位于甲状腺水平),B3型(甲状旁腺位于甲状腺下极以下)。以下甲状旁腺所在解剖位置分型,又可分为5型,分别为:BⅠ型(甲状旁腺位于气管食管沟);BⅡ型(甲状旁腺位于肩胛舌骨肌与胸骨甲状肌之间);BⅢ型(甲状旁腺位于颈动脉鞘周围);BIV型(甲状旁腺位于胸骨后胸腺区域内);BⅤ型(此型甲状旁腺位于其他位置)。2新西兰大白兔下甲状旁腺血管按照肉眼可见的血管数目分为6型,分别为:1+X支血管供血型;2支血管供血型;2+X支血管供血型;3支血管供血型;3+X支血管供血型;4支及4支以上血管供血型。[结 论]本文首次提出了新西兰大白兔下甲状旁腺位置分型和血管分型,为今后对新西兰大白兔甲状旁腺相关研究的动物实验模型建立提供了解剖学依据。第二部分甲状腺术后甲状旁腺缺血所致继发性低钙引发自身“二次损伤”,补钙能够抑制其“二次损伤”理论验证[目 的]验证甲状腺术后甲状旁腺缺血所致继发性低钙引发其自身“二次损伤”,并证实补钙能够抑制其“二次损伤”。[方 法]建立甲状旁腺体外“低氧低钙损伤”模型,CCK-8法测细胞增殖,流式细胞术测细胞凋亡,ELISA法测PTH,筛选具有损伤作用的O2体积分数。实验分为对照组、低氧低钙组、低氧常钙组、低氧补钙组,采用CCK-8法测细胞增殖,流式细胞术测细胞凋亡,ELISA法测PTH,WB测Active-Caspase-3、p38 MAPK表达水平。建立甲状旁腺血管损伤体内动物模型,分为假手术组、模型组、补钙组,分别于处理1d、3d、7d后ELISA法测PTH,比色法测血钙,HE染色观察组织、细胞形态结构变化,TUNEL染色测细胞凋亡率,WB测Active-Caspase-3、p3 8 MAPK 表达水平。[结 果]1体外细胞模型:1.1低氧导致甲状旁腺细胞“一次损伤”。1.1.1 CCK-8结果显示:甲状旁腺细胞存活率随O2体积分数降低而降低。1.1.2流式细胞术结果显示:甲状旁腺细胞凋亡率随O2体积分数降低而增高。1.1.3 ELISA结果显示:甲状旁腺细胞PTH水平随O2体积分数降低而降低。1.2低钙导致低氧损伤的甲状旁腺细胞“二次损伤”。1.2.1 CCK-8结果显示:低氧低钙组细胞存活率显著低于低氧组。1.2.2流式细胞术结果显示:低氧低钙组细胞凋亡率显著高于低氧组。1.2.3 ELISA结果显示:低氧低钙组PTH水平显著低于低氧组。1.2.4 WB结果显示:低氧低钙组Active-Casepase-3、p38 MAPK蛋白表达水平显著高于低氧组。1.3补钙处理能够抑制甲状旁腺细胞“二次损伤”。1.3.1 CCK-8结果显示:低氧补钙组细胞存活率显著高于低氧低钙组。1.3.2流式细胞术结果显示:低氧补钙组细胞凋亡率显著低于低氧低钙组。1.3.3 ELISA结果显示:低氧补钙组PTH水平显著高于低氧低钙组。1.3.4 WB结果显示:低氧补钙组Active-Casepase-3、p38 MAPK蛋白表达水平显著低于低氧低钙组。2体内动物模型:低钙导致缺血损伤的甲状旁腺细胞“二次损伤”,补钙处理能够抑制其“二次损伤”。2.1比色法结果显示:各组处理前后血钙均处于同一水平。2.2 ELISA结果显示:模型组1d和3d的PTH水平较处理前明显增高。2.3 HE结果显示:1d开始可见缺血甲状旁腺组织纤维化改变,3d时纤维化区域面积增加,7 d时纤维化更明显。2.4 TUNEL结果显示:补钙处理能够降低处理后1d、3d时细胞凋亡率。2.5 WB结果显示:补钙处理能够抑制p38 MAPK和Active-Caspase-3表达。[结 论]本实验建立了新西兰大白兔甲状旁腺体内“缺血低钙损伤”模型、体外“低氧低钙损伤”模型及体内外“损伤-补钙”模型,通过体内外实验证实低钙会给低氧损伤的甲状旁腺细胞带来“二次损伤”,加重甲状旁腺细胞凋亡,且p38 MAPK途径参与了这一过程,补钙能够抑制其“二次损伤”。第三部分补钙抑制“二次损伤”甲状旁腺细胞凋亡机制研究[目 的]初步探讨补钙通过抑制p38 MAPK途径抑制甲状旁腺“二次损伤”的生物学机制。[方 法]优化甲状旁腺细胞“二次损伤”细胞模型及“损伤-补钙”细胞模型条件,CCK-8法测不同Ca2+浓度时细胞存活率,筛选抑制细胞存活的Ca2+浓度和检测时间点,进一步筛选促细胞存活的补钙浓度和检测时间点。建立甲状旁腺细胞“二次损伤”体外细胞模型,分为对照组、模型组、补钙组、p38 MAPK抑制剂组、补钙+p38 MAPK抑制剂组、补钙+p38 MAPK激动剂组,ELISA法测 PTH,TUNEL 染色测细胞凋亡率,WB 测 Active-Caspase-3、Caspase-3、Caspase-6、Caspase-9、BCL2/BAX 表达水平,QPCR测p53、MAPKAPK2、MEF2C,JC-1测MMP水平。[结 果]1建立优化甲状旁腺细胞“二次损伤”体外细胞模型。1.1 CCK-8结果显示:O2体积分数为1%,Ca2+浓度为100 umol/L,12h出现甲状旁腺细胞存活率显著降低;补钙处理Ca2+终浓度为500 umol/L时,能够提高“二次损伤”甲状旁腺细胞的存活率,12h可以检测到明显促存活作用。2补钙通过抑制p38 MAPK蛋白表达抑制甲状旁腺“二次损伤”的生物学机制。2.1 ELISA结果显示:补钙和p38 MAPK抑制剂均能促进“二次损伤”细胞PTH分泌功能的恢复。2.2 TUNEL结果显示:补钙和p38 MAPK抑制剂均能降低“二次损伤”细胞凋亡率。2.3 WB结果显示:补钙和p38 MAPK抑制剂均能抑制“二次损伤”细胞Caspase-6、Caspase-9、Active-Caspase-3 蛋白的表达,通过促进 BCL2 表达,抑制BAX表达,维持BCL2/BAX值,对Caspase-3蛋白表达无显著影响。2.4 QPCR结果显示:补钙和p38 MAPK抑制剂均能下调“二次损伤”细胞p53基因,对MAPKAPK2和MEF2C无显著影响。2.5 MMP、电镜结果显示:补钙和p38 MAPK抑制剂均能稳定“二次损伤”细胞MMP,具有线粒体保护作用。[结 论]本研究确立了优化甲状旁腺“二次损伤”细胞模型及“损伤-补钙”细胞模型条件。证实补钙通过p38 MAPK/p53途径抑制甲状旁腺细胞凋亡,并通过抑制p38 MAPK的表达抑制MMP降低,对线粒体起保护作用。