一株杜氏藻的分子鉴定与耐盐特性研究

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杜氏藻属(Dunaliella)是绿藻门的一类重要经济微藻,可以用来生产β-胡萝卜素和甘油等产品。杜氏藻属的大多数物种极端耐盐,可以在含0.05~5.50M NaCl的培养液中生长,因此是研究植物耐盐机制的良好实验材料。本论文首先利用核基因ITS序列和叶绿体基因rbcL序列确定了一株杜氏藻的分类地位,再比较了不同NaCl浓度对该藻的生理生化特性、几种碳氮代谢酶活性及其基因表达的影响。旨在确定该藻的正确种属地位,筛选出适合该杜氏藻生长的NaCl浓度条件及该藻碳氮代谢酶对不同NaCl浓度的响应,从而为藻类耐盐机制提供更多资料。(1)对该藻进行了ITS序列和rbcL序列的克隆与序列测定,结果表明该藻株D3与GenBank数据库查找的23株杜氏藻的ITS序列之间的遗传距离在0.026~0.136之间,与21株杜氏藻的rbcL序列之间的遗传距离在0.005~0.060之间,由遗传距离和聚类图结果推断该杜氏藻株D3应该是绿色杜氏藻(D. viridis)。(2)比较了4种NaCl浓度对绿色杜氏藻的生长、叶绿素含量、蛋白质含量、总脂含量和叶绿素荧光参数的影响。结果表明1.00M NaCl培养绿色杜氏藻生长最快,培养至10d时,0.44M、2.00M和3.00M NaCl培养藻细胞密度分别是它的85.9%、93.2%和80.7%;该绿色杜氏藻叶绿素含量和可溶性蛋白含量均为1.00M NaCl培养最高;总脂含量在0.44~2.00M NaCl范围内随盐度升高而增加,2.00M NaCl培养总脂含量占干重的22.3%;叶绿素荧光参数Fv/Fm、ФPSII和qp在高盐(3.00M NaCl)培养显著降低,而NPQ则升高。(3)比较了4种NaCl浓度对绿色杜氏藻的碳固定酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)和CO2转化酶——碳酸酐酶(CA)活性及其基因表达的影响。结果表明绿色杜氏藻的Rubisco初始活力和总活力都是在1.00M NaCl培养最高,随着NaCl浓度升高其活力下降,到3.00M NaCl时分别降为最高值的37.33%和26.39%。在转录水平上,Rubisco大小亚基——rbcL和rbcS分别在1.00M和2.00MNaCl组表达量最高。胞外碳酸酐酶在0.44~2.00M NaCl范围内,随着NaCl浓度增加CA活性上升,在3.00M NaCl组CA活性受到抑制。而CA基因则在0.44~3.00M NaCl范围内,表达量一直上升。(4)比较了4种NaCl浓度对绿色杜氏藻的硝酸还原酶(NR)及其基因表达的影响。结果表明不同NaCl浓度对硝酸还原酶活性影响大多差异不显著,但对NR基因表达影响差异显著,在0.44~3.00M NaCl浓度范围内随NaCl浓度升高藻NR表达量降低,1.00M、2.00M、3.00MNaCl培养中的表达量分别是最高表达量的0.87倍、0.52倍和0.33倍。综合以上结果,本论文利用分子生物学方法将杜氏藻株D3定名为绿色杜氏藻,其最适生长NaCl浓度范围为1.00~2.00M NaCl。不同NaCl浓度对Rubisco活性、rbcL表达量的影响与对生长的影响趋势类似,都是在1.00MNaCl最高。胞外CA活性及其基因表达水平受NaCl诱导。不同NaCl浓度对硝酸还原酶活性影响不大,但是可以抑制其转录水平的表达。
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