论文部分内容阅读
红禾麻系2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载品种,为荨麻科艾麻属植物珠芽艾麻Laportea bulbifera(Siebold&Zuccarini)Weddell.的新鲜或干燥全草,贵州民间常用苗药,具有祛风除湿,活血化瘀的功效,是贵州特色优势产业民族药“润燥止痒胶囊”的原料药材。目前,红禾麻药材质量控制水平较低,生产原料主要来源于野生资源,药材质量良莠不齐,且在市场上流通较混乱,如蝎子草和艾麻等,从而严重影响了相关制剂的安全、有效和质量可控。 通过文献分析,红禾麻药材的化学成分及药理药效等研究报道较少,本文采用HPLC-MS/MS和NMR等技术对红禾麻中化学成分进行分析鉴别、分离提纯;参照《中国药典》2015版四部0502、0512方法,建立了红禾麻药材聚酰胺薄层色谱鉴别和高效液相色谱法含量测定方法;参照《中国药典》2015版四部2201、0832、2302方法进行浸出物、水分、总灰分、酸不溶性灰分含量测定。同时,采用超高效液相色谱法,建立了红禾麻不同极性部位的指纹图谱即“谱”,并以DPPH自由基清除法筛选红禾麻抗氧化活性部位,RAW264.7细胞模型筛选红禾麻抗炎活性部位,即“效”,分别建立了红禾麻抗氧化、抗炎活性“谱-效”关系。主要研究结果如下: 1.红禾麻药材质量控制研究 (1)化学成分分析鉴定:运用HPLC-MS/MS技术对红禾麻中化学成分进行分析鉴别初步推测得到部分色谱峰的化合物归属:1-3号峰均为咖啡先奎宁酸,分别为5-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸;10号峰为山奈酚-3-O-芸香糖苷;5、6、7号峰三者均为芦丁异构体;9号峰为槲皮苷异构体。采用D101大孔树脂、聚酰胺柱、制备液相等对红禾麻有效部位化学成分进行提取、分离得到1个单体化合物,同时运用NMR和LC-MS-MS技术鉴定该单体化合物为槲皮黄酮-3-芸香苷·芦丁。(2)薄层色谱鉴别结果:以槲皮黄酮-3-芸香苷·芦丁为对照品,采用聚酰胺为固定相,展开剂为氯仿-乙酸乙酯-甲醇-乙醇(1∶11∶4∶8),显色剂为AlCl3乙醇饱和溶液,测定分析了20个不同产地红禾麻药材,置紫外光灯(254nm)下检视结果显示:供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点或荧光斑点。(3)含量测定结果:以槲皮黄酮-3-芸香苷·芦丁作为指标性成分,采高效液相色谱法:色谱柱为Agilent SB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-水(15∶15∶70)等度洗脱,检测波长为360nm,对26个不同产地红禾麻药材进行含量测定,其含量在0.0946~4.97mg·g-1,暂时规定本品以干燥品计药材中含槲皮黄酮-3-芸香苷·芦丁应不少于0.01%,本品以干燥品计药材中含总黄酮以芦丁计应不少于1.0%。(4)浸出物、杂质测定含量结果:采用热浸法对26个不同产地红禾麻药材的50%乙醇浸出物含量测定,其结果为11.9~24.0%。水分含量为6.9~11.5%,总灰分含量为10.1~20.0%,酸不溶灰分含量为1.3~3.9%,暂时规定本品浸出物含量应不少于11.5%;水分含量应不得过11.5%,总灰分含量不得过20.0%,酸不溶灰分含量不得过4.0%。以上研究结果为红禾麻药材质量标准提升,保证该药材及相关制剂的安全有效和质量可控提供了实验依据。 2.红禾麻药材抗氧化、抗炎活性谱效关系研究 (1)药材不同极性部位指纹图谱建立:本实验通过测定条件筛选试验,建立了红禾麻药材水、乙酸乙酯、石油醚三个不同极性部位的UPLC指纹图谱及共有模式,并确定其各共有峰。(2)抗氧化活性部位筛选:运用DPPH自由基清除法测定得到各极性部位平均清除率结果为:乙酸乙酯部位(87.6%)>水部位(63.3%)>石油醚部位(36.8%),并结合SPSS软件进行方差分析筛选出红禾麻抗氧化活性部位为乙酸乙酯部位。(3)抗炎活性部位筛选:运用ELISA法测定巨噬细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)的分泌表达得到各极性部位的平均活化抑制率结果为:石油醚部位(15.38%)>乙酸乙酯部位(7.91%)>水部位(2.60%),并结合SPSS软件进行方差分析筛选出红禾麻抗炎活性部位为石油醚部位。(4)抗氧化活性谱效关系研究:本实验运用灰色关联度分析法以红禾麻43个不同产地药材乙酸乙酯部位清除率作为母因素,以其对应的乙酸乙酯部位指纹图谱中6个共有峰的相对峰面积为子因素进行关联度分析,结果显示:指纹图谱中Y5(tR=15.581min)、Y4(tR=14.129min)、Y2(tR=12.746min)对红禾麻抗氧化活性贡献较大,而采用逐步回归分析法分析得到Y2(tR=12.746min)与红禾麻抗氧化活性关系较紧密,两种不同的数据分析手段得到的结果相一致。(5)抗炎活性谱效关系研究:采用主成分分析法和灰色关联度分析法,对红禾麻43个不同产地药材石油醚部位活化抑制率及其对应石油醚部位指纹图谱6个共有峰进行分析,结果显示:指纹图谱中X4(tR=34.771min)、X1(tR=29.761min)、X6(tR=37.440min)对红禾麻抗炎活性贡献较大。同时采用聚类分析法对清除率>90%的32个产地及具有细胞抑制作用的26个产地分别进行了聚类分析,为后期深入研究所需药材采集以及红禾麻引种驯化良种选育研究提供了理论依据。该研究结果为红禾麻抗氧化抗炎药效物质基础深入研究奠定了理论基础。