[目的]三七为五加科人参属植物三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen的干燥根及根茎,其素有“生打熟补”之说,“生打”是指生三七具有活血化瘀、消炎镇痛、止血的功效,而“熟补”是指熟三七具有理气、补血、强身健体之功。已有研究表明,皂苷类成分是三七的主要活性成分,其在炮制过程中种类和含量的变化是导致生、熟三七药效差异的主要原因。当前对于三七皂苷类成分的制备工艺以及生物活性研究主要集中在生三七这一来源,对熟三七皂苷类成分的提取、纯化工艺及生物活性研究较少,阻碍了这种有价值药物的开发。对此,本课题在前期研究基础上,以熟三七主要活性成分人参皂苷Rh1、Rk3、Rh4、20(R)-Rg3及20(S)-Rg3为考察指标,以关联其传统功效的抗贫血、抗氧化等药理活性,采用特异性、适宜的提取、纯化技术获取优化熟三七皂苷类成分提取纯化工艺,并对获取的熟三七皂苷类成分进行生物活性及毒性评价,为熟三七皂苷类成分及其产品的开发利用奠定基础。[方法]1、收集三七的根及根茎,根据前期优化的熟制条件,在120℃、2 h的条件下制备熟三七样品。2、在单因素试验的基础上,利用Box-Behnken中心组合设计,以皂苷类成分含量、干膏率和抗氧化活性(EC50)值为评价指标,对提取时间、溶剂倍数、醇提浓度、提取次数等4个主要影响因素进行考察,并结合效应面法对熟三七皂苷类成分提取工艺进行优化。3、通过失效模式分析(FMEA)筛选纯化工艺的主要影响因素,采用星点设计-效应面法(CCD-RSM),以皂苷类成分的回收率和纯度为评价指标,对实验中5个主要影响因素包括上柱液浓度、上样体积、水洗体积、乙醇浓度、乙醇洗脱体积进行考察,对熟三七皂苷类成分的大孔吸附树脂纯化工艺进行优化。4、对熟三七皂苷类成分的体内抗氧化、免疫调节及抗贫血活性进行考察,并评价其急性毒性作用。[结果]1、以乙醇回流提取法为提取工艺,当提取时间为1.51 h,乙醇浓度为60%,提取次数为3次,溶剂倍数为10倍时,可以获得最优的结果:皂苷含量70.4883mg/g,干膏率 3 1.96%,EC50 值 0.0421mg/ml。2、以大孔吸附树脂为纯化工艺,当上柱液浓度为11.22 mg/ml,上样体积为4.97 BV,水洗体积为2 BV,乙醇浓度为70%,乙醇洗脱体积为3.31 BV时,可以获得最优的结果:皂苷回收率82.81%,皂苷纯度77.24%。3、熟三七皂苷类成分能显著提高小鼠外周血中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT)的水平,抗贫血活性与其皂苷类成分的浓度呈剂量依赖性的关系,浓度越高,抗贫血活性越好,纯化后的熟三七皂苷类成分的抗贫血活性与其15倍量的熟三七粉的抗贫血活性没有显著性差异。4、熟三七皂苷类成分能减轻环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制反应,显著增加小鼠脾脏和胸腺的脏器指数,以及碳粒廓清指数-k和吞噬指数-a,并增强巨噬细胞功能。免疫调剂活性与其皂苷类成分的浓度呈剂量依赖性的关系,浓度越高,免疫调节活性越好。5、熟三七皂苷类成分可以提高环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的抗氧化活性,显著提高小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平和总抗氧化能力(T-AOC),并降低小鼠体内丙二醛(MDA)水平。抗氧化活性与其皂苷类成分的浓度呈剂量依赖性的关系,浓度越高,抗氧化活性越好。6、熟三七皂苷类成分在小鼠急性毒性实验中未表现出明显的急性毒性症状,小鼠的脾、肝等脏器指数没有显著性的变化,熟三七粉及其皂苷类成分的LD50(半数致死量)高于5000mg/kg。[结论]优化后的熟三七皂苷类成分提取、纯化工艺简单、稳定,熟三七皂苷类成分含量和纯度较高,具有较好的免疫调节、抗氧化、抗贫血等作用,在小鼠急性毒性实验中未表现出明显的急性毒性。本研究为熟三七皂苷类成分及其产品的开发利用及其临床合理用药提供了一定理论基础。