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豹蛙酶(Onconase)是一种能够有效地抑制人白血病细胞和人腺癌细胞生长的核糖核酸酶,尤其对恶性间皮瘤疗效显著,目前已进入Ⅲ期临床研究阶段。本实验采用基因工程方法使豹蛙酶在大肠杆菌中得到高效表达,并研究其分离纯化工艺,得到生物活性较好的重组豹蛙酶蛋白。设计重组豹蛙酶的结构,在天然豹蛙酶序列前端添加肠激酶酶切位点,根据其氨基酸序列,采用大肠杆菌偏爱密码子设计合成8段引物,采用重叠延伸PCR法合成出目的基因,约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序,再连接至表达载体pET-22b(+中,重组质粒转入大肠杆菌Rosettatm (DE3)中。转化的重组大肠杆菌以IPTG诱导外源基因表达,采用Tricine-SDS-PAGE系统,分析目标蛋白主要以包涵体形式存在。温度为37℃时,pH为7.0,以物质的量浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导4h,目的基因在大肠杆菌中的表达最佳,其质量分数可达48.8%。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白,通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析,其覆盖率达到35%,确定了其蛋白质一级结构的正确性。通过对重组豹蛙酶的表达模式的研究,进一步确定其分离纯化工艺。包涵体经洗涤、变性、复性,使用肠激酶将融合蛋白部分切除,再采用SPFF强阳离子交换层析纯化,硫酸铵沉淀浓缩后,再通过Sephadex G-25分子筛收集活性组分,得到了纯度97.5%的豹蛙酶蛋白,发酵总产量达255mg/L,并具有较明显的体外核糖核酸降解活性。