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研究背景:氧对机体的新陈代谢,生长发育及维持内环境稳态具有不可替代的作用。机体供氧缺乏或氧代谢功能异常将引起细胞,组织,器官出现功能异常,继而引发诸多病理生理现象及一系列临床症状。研究人员发现,缺血缺氧对胰岛移植术后移植物功能产生严重影响,但缺血缺氧如何引起移植物功能丧失的机制鲜有报道。糖尿病是威胁国民健康的慢性病之一,其患病人群的大幅度上升及低龄化趋势,已引起医疗界及社会群众的广泛关注,已然成为我国乃至全世界最为棘手的慢性疾病之一。糖尿病患者治疗手段极为有限,传统的治疗方法不可能完全避免糖尿病并发症的发生,也不可能完全取代了胰岛内分泌功能。因此,胰岛移植疗法俨然成为终末期糖尿病患者最佳的治疗手段。然而胰岛移植物存活率低,移植后移植物功能丧失仍为最突出和严重的问题,阻碍了胰岛移植的发展。近些年,随着研究者不断探索,从糖尿病患者的胰腺组织尸检中发现了一种玻璃样变性,而后这种玻璃样变性被证实为人胰岛淀粉样多肽(hIAPP),此多肽具有空间构象易于错误折叠的特性,将导致其沉积于胰岛β细胞膜中,从而影响胰岛素的正常分泌,因此,我们怀疑胰岛移植过程中缺血缺氧会对hIAPP的沉积有所影响。本实验通过建立hIAPP-INS1细胞模型,进一步验证缺氧对hIAPP-INS1细胞内hIAPP沉积作用及相关胰岛素分泌功能的影响,为今后糖尿病及胰岛移植领域拓宽一个新的思路。实验方法:1.通过对大鼠胰岛素瘤细胞系(INS1)慢病毒转染,构建稳定过表达hIAPP的hIAPP-INS1细胞,建立具有嘌呤霉素抗性的全新胰岛素瘤细胞系(hIAPP-INS1)。嘌呤霉素2μg/ml筛选hIAPP-INS1细胞,持续14天,建立实验组hIAPP-INS1细胞株及对照组CON-INS1细胞株;通过qRT-PCR方法对比hIAPP-INS1细胞与CON-INS1细胞中hIAPP基因表达情况;通过荧光显微镜观察硫代硫磺素S染色后hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞中hIAPP沉积差异并检测两组细胞所表达的荧光强度的差异。2.将已经构建成功的hIAPP-INS1细胞模型和CON-INS1细胞模型分别在未缺氧,缺氧6小时,缺氧12小时,缺氧24小时,缺氧48小时条件下进行培养;通过MTS方法检测在不同缺氧时间段内hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞的增殖活性差异;通过荧光显微镜观察不同缺氧时间段硫代硫磺素S染色后hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞中hIAPP沉积程度的变化;通过化学发光仪检测不同缺氧时间段硫代硫磺素S染色后hIAPP-INS1细胞及CON-INS1细胞hIAPP沉积变化所表达的荧光强度差异;通过酶联免疫吸附法(ELISA)评价不同缺氧时间段hIAPP-INS1细胞及CON-INS1细胞在低葡萄糖浓度(2mM)及高葡萄糖浓度(20mM)刺激下,胰岛素分泌能力的变化;通过蛋白印记法(Western blot)检测不同缺氧时间段hIAPP-INS1细胞及CON-INS1细胞中LC3-II和P62自噬相关蛋白表达水平的变化。实验结果:1.hIAPP-INS1细胞及CON-INS1细胞模型的建立及验证研究:(1)相比于CON-INS1细胞,hIAPP-INS1细胞中hIAPP表达水平明显上调,p<0.0001。(2)相比于CON-INS1细胞,hIAPP-INS1细胞荧光强度增强,p<0.0001。2.缺氧对过表达hIAPP-INS1细胞系及CON-INS1细胞系中hIAPP沉积情况及相关功能的实验研究:(1)随着缺氧时间的延长,hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞活性逐渐降低,hIAPP-INS1细胞活性缺氧12h开始显著降低,hIAPP-INS1缺氧24h组和缺氧48h组与其各自未缺氧组相比,细胞增殖活性皆有统计学差异(P<0.05)。(2)随着缺氧时间的延长,CON-INS1细胞荧光强度无改变;hIAPP-INS1细胞在缺氧12h后,荧光强度显著增强,hIAPP-INS1缺氧12h组与缺氧6h组存在统计学差异(P<0.05),与hIAPP-INS1缺氧24h组存在显著统计学差异(p<0.05)。(3)hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞分别与各自未缺氧组相比,在缺氧12h和缺氧24h时,其葡萄糖刺激胰岛素分泌能力在低糖刺激时均无显著变化(p>0.05),高糖作下胰岛素分泌量降低(p<0.05)。(4)通过蛋白印记实验表明,hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞自噬相关基因LC3-Ⅱ表达水平在缺氧0~12h显著上调(P<0.05),与P62表达水平在同一缺氧时间段相反(p<0.05),说明自噬能力有所增强;缺氧12h后LC3-Ⅱ表达水平显著下调(P<0.05),与P62表达水平在同一缺氧时间段相反(p<0.05),说明自噬能力减弱。实验结论:1.过表达hIAPP大鼠胰岛素瘤细胞系(hIAPP-INS1)模型建立成功。2.hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞在缺氧12h及24h的条件下,胰岛素的分泌功能受限。3.hIAPP-INS1细胞和CON-INS1细胞在缺氧12小时前通过线粒体途径启动自噬,减轻细胞中hIAPP的沉积作用;缺氧12小时后,缺氧环境所致细胞损伤加重,自噬能力减弱,hIAPP沉积加重。