论文部分内容阅读
目的:探讨补肾中药吸收后血清对离体大鼠成骨细胞骨形成蛋白(BMP 6、BMP 7)、Smad 1、Smad 7、Smurf1、Smurf2等基因与蛋白表达,探讨骨形成蛋白的泛素-蛋白水解酶复合体通路(UPP)—Smad信号转导通路相关基因和蛋白表达的影响,研究肾虚骨质疏松症证候病机,观察补肾中药对其防治疗效及其作用机理。材料与方法:应用多次胶原酶消化法获得新生大鼠颅盖骨的成骨细胞进行培养,采用Gomori改良钙钴法测定其碱性磷酸酶表达;随机将实验大鼠分为正常组、补肾中药组、补脾中药组、骨疏康组,通过血清药理学方法,采用灌胃8天后各组大鼠血清,培养成骨细胞48小时;并且,另行加入UPP通路抑制剂MG132以及正常组、补肾中药组、补脾中药组、骨疏康组大鼠血清,培养成骨细胞48小时;用MTT法检测成骨细胞增殖,同时用RT-PCR法、Western印迹法检测成骨细胞BMP6、7、Smad1、7、Smurf1、2 mRNA与蛋白表达。结果:1.用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养,方便易行,可培养大量高纯度成骨细胞供研究使用。2.补肾中药血清作用48小时后可明显促进成骨细胞的增殖(P＜0.01),同时加MG132血清可诱导抑制成骨细胞的增殖率(P＜0.05)。3.成骨细胞BMP6 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,补肾中药组基因表达水平无显著差异(P＞0.05)而蛋白表达增高(P＜0.05),其它各组基因与蛋白表达水平明显降低(P＜0.05,P＜0.01)。使用药物血清各组比较,补肾中药组表达水平高于补脾中药组与骨疏康组(P＜0.01)。加入MG132药物血清组间,无明显差异(P＞0.05)。4.成骨细胞BMP7 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,补肾中药组基因表达水平增高(P＜0.01)而蛋白表达无显著差异(P＞0.05),其它各组基因与蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),使用药物血清各组比较,补肾中药组表达水平高于补脾中药组与骨疏康组(P＜0.01)。加入MG132药物血清各组间,MG132+正常组表达水平最高(P＜0.05)。5.成骨细胞Smad1 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,补肾中药组基因表达水平无显著差异(P＞0.05)而蛋白表达降低(P＜0.01),其它各组基因与蛋白表达水平明显降低(P＜0.01)。使用药物血清各组比较,补肾中药组表达水平高于补脾中药组与骨疏康组(P＜0.01)。加入MG132药物血清各组比较,MG132+补肾中药组基因与蛋白表达水平明显高于MG132+补脾中药组(P＜0.01,P＜0.05)。6.成骨细胞Smad7 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,各组均可明显上调表达水平(P＜0.01,P＜0.05)。使用药物血清各组比较,补脾中药组基因与蛋白表达水平最高(P＜0.05)。加入MG132药物血清各组比较,MG132+补脾中药组基因表达水平明显低于其它加MG132药物血清各组(P＜0.01),而MG132+补肾中药组蛋白表达水平明显上调其他加MG132药物血清各组(P＜0.01)。7.成骨细胞Smurf1 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,其它各组表达水平明显下降(P＜0.01),使用药物血清各组比较,补肾中药组表达水平明显高于补脾中药组与骨疏康组(P＜0.01)。加入MG132药物血清组间,MG132+正常组基因表达水平最高(P＜0.05),MG132+骨疏康组蛋白表达水平最高(P＜0.05)。8.成骨细胞Smurf2 mRNA与蛋白表达情况:与正常组比较,补肾中药组基因表达水平上调(P＜0.01)而蛋白表达水平无明显差异(P＞0.05),其它各组明显低于正常组(P＜0.01)。加入MG132药物血清组间,基因表达无明显差异(P＞0.05),MG132+骨疏康组蛋白表达水平最高(P＜0.05)。结论:1.采用药物血清作用于体外培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞的方法是较为稳定可靠的血清药理学方法。2.体外培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞中存在泛素-蛋白水解酶复合体通路(UPP)-Smad蛋白其信号转导通路。3.应用补肾中药血清可明显促进成骨细胞增殖,明显上调成骨细胞BMP6、BMP7、Smad1、Smurf1、Smurf2的基因与蛋白表达,下调抑制性信号转导因子Smad7的基因与蛋白表达。4.应用UPP通路抑制剂MG132可明显抑制成骨细胞增殖,并明显抑制成骨细胞中BMP6、BMP7、Smad1、Smad7、Smurf1、Smurf2的基因与蛋白表达。5.应用补肾中药血清具有干预MG132抑制对成骨细胞增殖的作用,对成骨细胞中BMP6、BMP7、Smad1、Smad7、Smurf1、Smurf2的基因与蛋白表达水平具有明显上调作用,明显优于MG132+补脾中药组。