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研究目的:肝脏具有强大的再生功能,一旦肝脏受到损伤或肝实质减少,现有的肝细胞通过再生来维持肝脏的稳态和肝功能,但是在慢性肝损伤或亚大片肝细胞丢失的情况下,肝脏再生功能受到抑制甚至被破坏,此时肝祖细胞（hepatic progenitor cell,HPC）活化并增殖和分化,以维持肝脏的稳态。Y-box结合蛋白1（YB-1）在人肝纤维化肝组织中高表达,但其与HPC介导的肝纤维化和肝脏再生之间的关系尚不明确,本研究旨在探讨YB-1调控HPC向肝细胞分化的分子机制,及其在HPC介导的肝脏再生和肝纤维化中的作用。研究方法:在人和小鼠肝组织中,采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）、蛋白免疫印迹（western blot,WB）、免疫组织化学技术检测YB-1,Wnt3的表达和分布,CK19+YB-1、CK19+Wnt3免疫荧光双标观察YB-1和Wnt3在CK19阳性的HPC中表达和分布情况。应用HE和Masson染色观察肝损伤和肝纤维化程度。应用胶原酶灌注法和密度梯度离心法分离并鉴定HPC,应用3D（three dimention）培养技术体外诱导HPC向肝细胞分化,应用基因干预技术分别沉默和过表达YB-1,采用免疫荧光、WB和qRT-PCR方法检测HPC标志物CK19、AFP,肝细胞标志物白蛋白、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）、肝细胞核因子4α（hepatic nuclear factor 4 alpha,HNF4α）,YB-1及p-YB-1表达情况,应用酶联免疫吸附试验检测HPC分泌白蛋白和尿素的水平。应用油红O染色、吲哚菁绿摄取和储存实验、高尔基体（golgi complex）荧光探针、内质网（endoplasmic reticulum）荧光探针、线粒体（mitochondria）荧光探针观察分化的HPC功能变化。采用染色质免疫共沉淀结合高通量测序技术（ChIP-seq）检测YB-1在HPC中与Wnt3启动子结合位点,并通过ChIP-PCR进行验证,采用双荧光素酶报告基因法检测YB-1对Wnt3启动子转录活性的调控作用,WB和qRT-PCR检测Wnt3、β-catenin、c-Myc、Axin-2及CyclinD1表达情况。在调控YB-1的基础上,分别沉默和过表达Wnt3,应用WB和qRT-PCR检测Wnt3、β-catenin、c-Myc、Axin-2、CyclinD1、CK19、AFP、白蛋白、GS、HNF4α、YB-1及p-YB-1表达情况,并进一步验证分化的HPC功能变化。CK19+HNF4α免疫荧光双标研究小鼠肝损伤模型HPC向肝细胞分化情况,经脾脏移植HPC治疗小鼠肝损伤模型,苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）观察治疗前后肝脏损伤情况、白蛋白+GFP（green fluorescent protein,GFP）免疫荧光双标观察移植的HPC在肝内分布情况,ELISA检测治疗后小鼠血清中白蛋白和尿素含量,评估肝功能变化。研究结果:1.正常人和正常小鼠肝组织不表达YB-1,低表达Wnt3,慢性乙型病毒性肝炎相关肝硬化患者及小鼠肝损伤模型的肝组织中高表达YB-1和Wnt3,且在胆管反应区和CK19阳性的HPC中最为显著,并与肝纤维化程度呈正相关。2.分化的HPC白蛋白、GS、HNF4α表达增加,而CK19和AFP表达下降,YB-1和p-YB-1表达下降,且具有合成脂滴,吸收吲哚菁绿,分泌白蛋白和尿素的能力,并且线粒体、高尔基体、内质网代谢活性增加。3.基因干预技术沉默YB-1可以促进Wnt3、β-catenin、c-Myc、Axin-2、CyclinD1表达;同时促进白蛋白、GS、HNF4α表达,进一步减少CK19、AFP表达,促进HPC合成脂滴、吸收吲哚菁绿、分泌白蛋白和尿素的能力。过表达YB-1抑制Wnt3、β-catenin、c-Myc、Axin-2、CyclinD1表达,同时抑制白蛋白、GS、HNF4α表达,促进CK19和AFP表达。降低HPC合成脂滴、吸收吲哚菁绿、分泌白蛋白和尿素的能力。4.ChIP-sequence与ChIP-PCR证实YB-1在Wnt3启动子区存在结合位点,双荧光素酶酶报告基因显示沉默YB-1后Wnt3启动子荧光素酶活性显著增加,而过表达YB-1后Wnt3启动子荧光素酶活性显著下降。通过生物信息学对比发现YB-1在Wnt3基因距离转录起始点上游5’UTR39366bp处存在结合位点。5.在沉默YB-1的基础上进一步沉默Wnt3,qPCR和WB证实沉默Wnt3抑制白蛋白、GS、HNF4α表达,促进CK19和AFP表达,降低合成脂滴、吸收吲哚菁绿、分泌白蛋白和尿素的能力。在过表达YB-1的基础上过表达Wnt3,促进白蛋白、GS、HNF4α表达,进一步减少CK19、AFP表达,促进其合成脂滴,吸收吲哚菁绿,分泌白蛋白和尿素的能力。6.CK19+HNF4α免疫荧光双标显示在慢性乙型病毒性肝炎肝硬化患者及小鼠慢性肝损伤模型的肝脏中,存在CK19和HNF4α双阳性细胞,但阳性率较低约为1-1.5%。7.经脾脏移植HPC治疗小鼠肝损伤,发现白蛋白、GFP双阳性移植的HPC散在分布于损伤的肝脏中,肝损伤程度较未进行HPC移植治疗的肝损伤程度明显减轻,并且血清白蛋白水平明显升高,而血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平明显。主要结论:1.YB-1表达水平同肝纤维化和肝损伤程度呈正相关。2.CK19阳性的HPC可定向分化为肝细胞。3.YB-1在Wnt3启动子距离转录起始点上游5’UTR 39366 bp处存在结合位点。4.YB-1能通过负性调节Wnt3启动子调控Wnt/β-catenin信号通路进而调节HPC向肝细胞分化。5.经脾脏移植HPC治疗小鼠慢性肝损伤,可以明显减轻肝损伤程度并改善肝脏功能。