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银耳(Tremella fuciformis)因其特殊性而成为了理想的外源基因表达宿主,但外源基因表达水平偏低是该表达系统的一个瓶颈问题。目前国内外尚未见外源基因在银耳芽孢中的表达体系的系列研究报道。本研究构建了一系列不同的表达调控载体,转化银耳芽孢,通过外源基因表达量的检测确定高表达调控体系,同时通过调节银耳芽孢细胞膜通透性来优化外源基因在银耳芽孢中的表达量。具体研究结果如下:1.8个不同真核表达载体的构建以pTEll、pCAMBIA1301、pET-28a-rftp、pA0815-lacZ、pMDI8-TAT-survivin(T34A)为出发载体,通过设计引物、PCR扩增、酶切、连接等一系列分子生物学方法,成功构建了含有编码红色荧光蛋白(red fluorescent protein)的rfp基因、编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的lacZ基因、编码漆酶的Lacccse基因和编码凋亡抑制因子的survivin(T34A)突变体基因的8个不同真核表达载体pTEIl-rfp、pTEIl-lacZ、pTEIl-Laccase、pTEll-survivin(T34A)、pTEIl-co-survivin(T34A)、pC AMBIA13 01-survi vin(T34A)、pC AMBIA1301-s-survivin(T34A)和pCAMBIA1301-co-survivin(T34A)。其中,表达载体pTE1l-rfp、pTEll-lacZ、pTE1 1-Laccase、pTEl 1-survivin(T34A)、pTEl 1-co-survivin(T34A)中的目的基因是在稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的强启动子RP27调控下。co-survivin(T34A)是密码子优化后的survivin基因突变体,表达载体pCAMBIA1301-survivin(T34A)、pC AMBI A1301-s-survivin(T34A)、pCAMBIA 1301-co-survivin(T34 A)是在花椰菜花叶病毒启动子CaMV 35S调控survivin(T34A)基因、添加了信号肽的survivin(T34A)基因(s-survivin(T34A))和密码子优化后的survivin(T34A)基因(co-survivin(T34A))。2.表达载体转化银耳芽孢及表达分析将毕赤酵母表达载体pPICZα A-Laccase、pA0815-lacZ和上述构建的8个银耳表达载体转化银耳芽孢。经两轮抗性筛选获得41个转化子,提取转化子基因组进行PCR鉴定,结果表明所有目的基因已经成功整合到银耳芽孢中。荧光显微镜观察pTEl1-rfp转化子有明显的红色荧光,证明rfp基因已成功在银耳芽孢中表达,且RP27启动子可以调控外源基因rfp在银耳芽孢中的正确表达。在CM/Amp/IPTG/X-Gal平板上对pA0815-lacZ和pTEl 1-lacZ转化子进行诱导表达,发现转化子显蓝,采用ONPG比色法检测转化子中β-半乳糖苷酶酶活分别为14.08 U/L和7.55 U/L,证明lacZ基因可以在银耳芽孢表达。采用ABTS法对pPICZαA-Laccase和pTEl 1-Laccase转化子进行漆酶酶活测定,结果表明pPICZαA-Laccase和pTE11-Laccase转化子中漆酶酶活分别为0.40 U/L和0.27 U/L,而对照组未检测出相应酶活,证明两个转化子均已成功表达漆酶基因。综上可知,在银耳芽孢中,酵母表达载体比pTEll表达载体表达外源基因效率高。3.不同方法对银耳芽孢细胞膜通透性的影响通过添加有机溶剂、表面活性剂、膜表面作用抗生素及无机盐类物质来调控银耳芽孢细胞膜通透性,考察其对胞外漆酶含量及细胞存活率的影响。结果表明,二甲基亚砜(DMSO)、Tween80、TritonX-100、两性霉素B和氯化钾均可在一定程度上提高细胞膜通透性,提高细胞内的漆酶分泌到细胞外,增强漆酶的代谢通量,从大到小的顺序依次是DMSO、TritonX-100、Tween80、两性霉素B和氯化钾。而剧烈的表面活性剂(SDS)及有机溶剂(甲苯、戊二醛)则不利于银耳芽孢的生长及漆酶的分泌,这有可能是因为其对银耳芽孢具有强烈的破坏作用,导致银耳芽孢大量死亡,从而影响了漆酶的合成。