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目的通过构建不同程度积水肾不同大小急性灌注压力负荷损伤的动物及细胞模型,探讨急性灌注压力负荷损伤对积水肾纤维化的影响,同时阐明肾小管上皮细胞分泌的外泌体介导的上皮间质交流在其中发挥的作用及可能的分子机制,从而丰富肾纤维化的发生理论,为临床积水肾脏的保护提供理论依据,为围术期灌注压力负荷所致积水肾纤维化的分子干预提供新思路。方法1.急性灌注压力负荷对积水肾的影响:构建不同程度积水肾不同大小急性灌注压力负荷损伤大鼠模型,采用HE染色,TUNEL染色,NGAL免疫组化检测肾损伤情况,通过TGF-β1（转化生长因子β1）,Col-I（I型胶原纤维）,α-SMA（α平滑肌肌动蛋白）及E-cad（上皮型钙黏连蛋白）蛋白免疫组化染色检测肾组织纤维化情况。2.急性灌注压力负荷对TGF-β1诱导过的NRK-52E细胞的影响:构建不同浓度TGF-β1刺激及不同大小急性灌注压力负荷损伤的NRK-52E细胞模型,采用CCK-8检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,免疫荧光检测α-SMA和Fibronectin（纤维连接蛋白）的表达。3.NRK-52E细胞分泌的外泌体的分离、提取及鉴定:构建TGF-β1刺激及急性灌注压力负荷损伤的NRK-52E细胞模型,采用超速离心法分离提取细胞上清液中的外泌体并通过透射电镜,纳米颗粒跟踪分析及Western blot予以鉴定。4.NRK-52E细胞分泌的外泌体对NRK-49F细胞的影响:超速离心法提取TGF-β1刺激及急性灌注压力负荷作用后NRK-52E细胞分泌的外泌体并干预经TGF-β1诱导过的NRK-49F细胞,通过Western blot检测NRK-49F细胞α-SMA的表达,免疫荧光检测Col-I及Fibronectin的表达。此外,设置外泌体分泌抑制剂GW4869干预组和外泌体核酸酶处理组,同样检测上述指标的表达。5.NRK-52E细胞分泌的外泌体中mi RNA测序以及差异表达micro RNA的功能和通路预测:试剂盒提取NRK-52E细胞分泌的外泌体并行micro RNA高通量测序,生信软件预测差异表达micro RNA的靶标并行GO分析和KEGG通路分析。6.确定NRK-52E细胞分泌的外泌体中需要后续研究的micro RNA并预测其靶标:根据测序结果并结合相关文献确定研究对象为micro RNA-23a,q RT-PCR验证外泌体中micro RNA-23a的表达,生信软件预测出micro RNA-23a的可能靶标Sno N并行荧光素酶报告基因予以验证。7.NRK-52E细胞分泌的外泌体中micro RNA-23a对NRK-49F细胞的影响及机制研究:通过转染micro RNA-23a的模拟物或抑制剂过表达或抑制NRK-52E细胞分泌的外泌体中的micro RNA-23a,提取外泌体并经q RT-PCR验证后干预NRK-49F细胞,CCK-8检测NRK-49F细胞增殖,免疫荧光检测Col-I及Fibronectin的表达,Western blot检测Sno N蛋白及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。8.NRK-52E细胞来源的外泌体对大鼠积水肾脏的影响及机制研究:超速离心提取NRK-52E细胞分泌的外泌体,通过尾静脉注射进入积水肾大鼠体内,Masson染色,天狼星红染色及免疫荧光检测肾组织纤维化情况,q RT-PCR检测肾组织内micro RNA-23a表达,免疫组化和免疫荧光检测Sno N蛋白及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。9.动物实验验证外泌体在积水肾液体灌注压力负荷后肾纤维化中的作用及机制:建立Rab27a基因敲除小鼠的积水肾急性压力灌注负荷损伤模型,Masson染色,天狼星红染色及免疫荧光检测肾组织纤维化情况,免疫荧光及Western blot检测肾组织Sno N蛋白及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。结果1.急性灌注压力负荷对积水肾的影响:急性灌注压力负荷可导致积水肾组织损伤加重,纤维化指标表达增高,且积水越严重的肾脏越容易受到急性灌注压力负荷的影响。2.急性灌注压力负荷对TGF-β1诱导过的NRK-52E细胞的影响:急性灌注压力负荷可以加重TGF-β1刺激导致的NRK-52E细胞损伤并促进NRK-52E细胞向间质细胞转化,且TGF-β1浓度越高,NRK-52E细胞越容易受影响。3.NRK-52E细胞分泌的外泌体的分离、提取及鉴定:透射电镜及纳米颗粒跟踪分析显示颗粒直径主要分布在100nm左右,Western blot可以检测到外泌体标志性蛋白CD63,Alix,TSG-101的表达,证明提取到的物质为外泌体。4.NRK-52E细胞分泌的外泌体对NRK-49F细胞的影响:TGF-β1刺激及液体灌注压力负荷作用后NRK-52E细胞分泌的外泌体可以促进NRK-49F细胞α-SMA,Col-I及Fibronectin的表达;给予GW4869抑制外泌体分泌或者用核酸酶处理外泌体后,α-SMA,Col-I及Fibronectin的表达明显降低;这证明TGF-β1刺激及急性灌注压力负荷后NRK-52E细胞分泌的外泌体可以促进NRK-49F细胞向肌成纤维细胞转化且发挥作用的主要物质为核酸。5.NRK-52E细胞分泌的外泌体中mi RNA测序以及差异表达micro RNA的功能和通路预测:TGF-β1刺激合并急性灌注压力负荷组相较单纯TGF-β1刺激组共有5种micro RNA表达明显升高,其中micro RNA-23a是其中变化最为明显的;此外,差异表达的micro RNA可能参与细胞转化功能,并可能涉及到TGF-β相关信号通路。6.确定NRK-52E细胞分泌的外泌体中需要后续研究的micro RNA并预测其靶标:根据测序结果并结合相关文献我们最终确定研究外泌体中差异表达的micro RNA-23a,q RT-PCR证实外泌体中micro RNA-23a的表达与测序结果一致;通过Targrtscan等软件我们预测到Sno N为micro RNA-23a的可能靶标,双荧光素酶报告基因也证明Sno N为micro RNA-23a的直接作用靶标。7.NRK-52E细胞分泌的外泌体中micro RNA-23a对NRK-49F细胞的影响及机制研究:q RT-PCR证明过表达或者抑制NRK-52E细胞分泌的外泌体中的micro RNA-23a是有效的;过表达外泌体中的micro RNA-23a后NRK-49F细胞增殖力增加,Col-I,Fibronectin的表达明显升高,Sno N的表达明显降低,且TGF-β/Smad信号通路被活化;然而,抑制外泌体中的micro RNA-23a后NRK-49F细胞增殖力下降,Col-I,Fibronectin的表达明显降低,Sno N的表达明显升高,且TGF-β/Smad信号通路被抑制。8.NRK-52E细胞来源的外泌体对大鼠积水肾脏的影响及机制研究:注射micro RNA-23a模拟物干预的NRK-52E细胞分泌的外泌体后,肾组织纤维化程度加重,Sno N表达下降且TGF-β/Smad信号通路被激活;注射micro RNA-23a抑制剂干预的NRK-52E细胞分泌的外泌体后,肾组织纤维化程度减轻,Sno N表达升高且TGF-β/Smad信号通路被抑制。9.动物实验验证外泌体在积水肾急性灌注压力负荷后肾纤维化中的作用及机制:Rab27a基因敲除可以减轻积水造成的肾间质纤维化并抑制TGF-β/Smad信号通路的激活。对于正常小鼠,肾积水合并急性灌注压力负荷组相较单纯肾积水组,组织纤维化程度加重,Sno N表达下降且TGF-β/Smad信号通路活化更明显。然而对于Rab27a-/-小鼠,以上指标变化并不明显;这说明Rab27a基因可以抑制外泌体分泌并可能通过改变Sno N及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达来降低积水肾急性灌注压力负荷损伤后肾组织纤维化的程度。结论急性灌注压力负荷可促进积水肾组织纤维化的进展,外泌体介导的上皮间质交流在其中发挥了重要作用,其可通过促进肾小管上皮细胞分泌外泌体并运载高含量的micro RNA-23a靶向成纤维细胞Sno N基因,削弱Sno N基因对于TGF-β/Smad信号通路的负反馈抑制,从而促进成纤维细胞增殖并向肌成纤维细胞转化,最终导致肾脏纤维化的进展。