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嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)是将识别肿瘤抗原的抗体分子和T细胞活化信号耦合的融合分子。经CAR修饰的T细胞将单克隆抗体的精确靶向特异性与细胞毒性T细胞的强毒性和持久性相结合,能够特异性识别肿瘤相关抗原而不依赖MHC限制,从而高效持久地杀伤肿瘤细胞。迄今为止,CAR T细胞免疫治疗已经在血液恶性肿瘤的临床治疗中取得了显著的疗效,但对实体肿瘤的治疗并未取得突破性进展。究其原因可能和实体肿瘤组织表面高度特异性肿瘤抗原的缺失有关。一个理想的靶抗原应当在肿瘤组织表面高表达,在正常组织不表达或低表达。上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是结肠癌、肝癌等恶性肿瘤的干细胞标志之一,在肿瘤组织高表达,在正常组织仅在基底膜外侧表达。本研究中,我们以EpCAM为靶点,构建靶向EpCAM的CAR T细胞,探究靶向EpCAM的CAR T细胞对EpCAM+结肠癌细胞的杀伤能力。目的本课题以EpCAM为研究靶点,构建稳定表达EpCAM-CAR基因的T细胞,探究靶向EpCAM的CAR T细胞对EpCAM+结肠癌细胞的杀伤能力。材料与方法(1)转化、鉴定、扩增pCLK-EF-1 kana EpCAM-CAR,psPAX2、pMD2.G这三个病毒包装质粒;(2)利用磷酸钙法转染293T细胞以制备重组慢病毒颗粒,超高速离心以浓缩重组慢病毒颗粒,实时荧光定量PCR法检测重组慢病毒的滴度;(3)利用免疫蛋白印迹法和流式细胞术检测EpCAM在五种结肠癌细胞株(SW620、SW480、HCT116、LoVo、HT-29)中的表达;(4)人外周血单核细胞的提取及T细胞的活化、培养;(5)用携带EpCAM-CAR基因表达框的重组慢病毒颗粒转染人T淋巴细胞;(6)利用免疫蛋白印迹法、定量PCR法及流式细胞术检测转染后T细胞中CAR的表达;利用流式细胞术检测转染后中央记忆型T细胞的比例;(7)以携带epcam-car基因的t细胞为实验组效应细胞,以未转染的t细胞为对照组效应细胞,与epcam高表达的结肠癌细胞sw620按0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1的效靶比共培养,与结肠癌细胞sw480、hct116、lovo、ht-29按16:1的效靶比共培养。通过乳酸脱氢酶释放实验检测cart细胞对结肠癌细胞的杀伤能力;(8)以携带epcam-car基因的t细胞为实验组效应细胞,以未转染的t细胞为对照组效应细胞,与epcam高表达的结肠癌细胞sw620按0.5:1、1:1、2:1、4:1、8:1、16:1的效靶比共培养,与结肠癌细胞sw480、hct116、lovo、ht-29按16:1的效靶比共培养。利用酶联免疫吸附法检测cart细胞释放炎性细胞因子的水平。结果(1)成功转化、扩增pclk-ef-1kanaepcam-car、pspax2、pmd2.g这三个质粒;(2)成功包装携带epcam-car基因表达框的慢病毒;(3)结肠癌细胞行免疫蛋白印迹及流式细胞术结果显示:结肠癌细胞株sw620、sw480、hct116、lovo、ht-29表面epcam的阳性表达率分别为97.5%、85.4%、78.3%、75.4%、67.3%;(4)成功分离、激活t淋巴细胞,并大量增殖;(5)携带epcam-car基因表达框的慢病毒转染t淋巴细胞,rt-pcr和wb检测显示;转染后t细胞中存在epcam-car的表达;流式细胞术检测显示:转染后t细胞表面epcam-car的表达为50.4%;(6)与对照组相比,转染后的t细胞组,中央记忆型t细胞的比例增多;(7)实验组和对照组t细胞与五种结肠癌细胞共培养后行乳酸脱氢酶释放实验检测epcam-cart细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,结果显示:epcam-cart细胞对epcam+结肠癌细胞发挥杀伤作用,杀伤能力随着效靶比及肿瘤细胞表面epcam表达升高而逐渐增强;(8)实验组和对照组t细胞与五种结肠癌细共培养后行酶联免疫吸附实验检测细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)的释放水平,结果显示:与对照组相比,实验组T细胞炎性细胞因子(IL-2、IFN-γ、IL-6)的分泌水平更高,其分泌水平随着效靶比及肿瘤细胞表面EpCAM表达升高而逐渐升高。结论1.成功构建靶向EpCAM的CAR T细胞;2.靶向EpCAM的CAR T细胞可以识别并杀伤EpCAM+的结肠癌细胞;3.CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于CAR T细胞的数量和肿瘤细胞表面EpCAM的表达;