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骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种由多种因素如物理因素、生物化学因素、生物力学因素及遗传因素造成的复杂的关节退行性疾病。肥胖被认为是骨关节炎发生发展的主要危险因素之一。肥胖能够造成骨关节炎关节炎症状态及软骨退化。目前研究数据表明脂肪组织的代谢产物瘦素（leptin）可能与肥胖和骨关节炎的发生密切相关,同时也为肥胖人群中骨关节炎高发生率提供了可能的解释。软骨细胞是软骨组织中仅有的一种细胞类型,软骨细胞合成代谢和分解代谢的失衡决定了关节软骨的退化,是骨关节炎最主要的病理特征。越来越多的数据支持leptin是骨关节炎发生发展过程中的关键危险因子。leptin是由Zhang et al.[1]于1994年发现的第一个脂肪来源的激素。人leptin是由位于染色体7q31.3上的基因所编码的16kDa的蛋白[2]。其他的组织如肠、胎盘、乳腺、胃上皮、骨骼肌、大脑[3]、关节组织和骨[4-9]也能产生leptin。这种激素在大脑中作为一种食欲调节因子,通过诱导食欲减退因子产生及抑制促食欲神经肽产生而降低食物摄入,增加能量消耗[10]。leptin通过特异性地与leptin受体（OBR）结合而发挥功能。OBR是由糖尿病基因所编码,属于I类细胞因子受体超家族,能够诱导IL-6,LIF,CNTF,OSM,G-CSF和gp130产生。OBR的六个选择性的拼接亚基已经被确定。这些亚基包含有相同的胞内结合域,但是它们胞浆域的长度不同:有一个长亚基（OB-Rb）,4个短亚基（OB-Ra,OB-Rc,OB-Rd,OB-Rf）和一个可溶性亚基（OB-Re）。然而,仅有长亚基（OB-Rb）有完整的胞内域及细胞因子受体典型的信号元件,能够转导leptin结合信号到细胞核。血液循环中的leptin既具有与血浆蛋白及可溶性leptin受体亚基OB-Re相关的自由型的生物活性又具有约束型的失活形式[11]。Ob-Rb没有内在的酪氨酸激酶活性,但是能够与leptin结合,募集细胞质激酶如JAK2激活leptin信号[12,13]。leptin受体的功能是产生激素促使JAK2自动磷酸化[14,15]。JAK2是被三种酪氨酸残基（Tyr985,Tyr1077,Tyr1138）磷酸化所激活,每个酪氨酸磷酸化位点均参与其他不同信号蛋白的募集[16]。骨关节炎患者血浆leptin水平与身高体重指数（BMI）呈正相关。在绝经前期妇女血浆中leptin浓度在三个时间点上比男性高[17,18]。Karvonen-Gutierrez研究表明在中年女性中血浆leptin水平与膝骨关节炎呈正相关[19]。在骨关节炎患者的关节液中也检测到leptin,有意思的是,关节液中leptin水平比血清中要高。此外,Ku et al.研究表明,在骨关节炎患者关节液中leptin水平与骨关节炎的严重程度呈正相关[20],也与MMP-1和MMP-3的水平呈正相关。这些结果表明leptin可能作为骨关节炎诊断的一个潜在生物标志物[20]。然而关于leptin在骨关节炎软骨退化中的具体作用机制仍尚不清楚,因此本研究以leptin为切入点,着重探讨leptin在骨关节炎中的作用及机制。基于以上研究背景和课题设想,本研究分为如下两个部分:一、leptin下调DUSP19表达诱导线粒体依赖性的活性氧（ROS）激活NF-κB通路参与骨关节炎病理过程我们分析NCBI基因表达数据库（序列号:GSE57218）发现,相对于健康软骨组织,双特异性磷酸酶19（DUSP19）在骨关节软骨组织中表达水平降低。为进一步确定DUSP19在骨关节炎软骨中的表达,我们采用定量PCR和免疫组化的方法对45例骨关节炎患者及25例健康捐赠者关节软骨组织中的DUSP19 mRNA及蛋白水平进行检测。结果显示相对于健康对照组关节软骨组织,在关节炎软骨组织中DUSP19 mRNA水平增加76.7%,免疫组织化学结果与定量PCR结果一致。定量PCR分析骨关节炎关节软骨组织中细胞因子IL-1β,TNF-α,IL-6及leptin,adiponectin mRNA水平表达。结果显示相对于健康对照组,在骨关节炎软骨组织中leptin、IL-1β、TNF-α、IL-6和adiponectin m RNA水平分别增加了62.9%、59.5%、74.0%、65.1%和88.4%,Pearson相关分析结果显示在骨关节炎软骨组织中DUSP19mRNA水平与leptin成呈负相关,而与IL-1β,TNF-α、IL-6和adiponectin间不存在相关性。这些结果表明DUSP19与leptin间的相关性可能参与骨关节的病理过程。为进一步探索DUSP19在骨关节炎中的作用,我们构建骨关节炎SD大鼠模型,并对此模型大鼠注射NAC（ROS通用抑制剂）。结果显示相对于模型组,NAC注射组大鼠软骨表层细胞数量增加,大多呈小圆形,辐射层细胞形态较小,潮线紊乱。表明在OA大鼠模型中注射NAC能够减弱骨关节炎样病变严重程度。相对于OA组,在OA+NAC组中DUSP19 mRNA水平增加70.6%,而leptin,IL-1β,TNF-α,IL-6和adiponectin mRNA水平分别降低28.3%、31.8%、28.6%、29.7%和33.3%。表明DUSP19参与骨关节病理过程,而ROS的抑制剂NAC能够部分缓解骨关节退化程度。Pearson相关分析结果显示模型动物骨关节炎软骨组织中DUSP19mRNA水平与leptin成呈负相关,而与IL-1β,TNF-α,IL-6和adiponectin间不存在相关。我们结果已经表明DUSP19和leptin表达呈负相关,为进一步探索leptin对DUSP19表达的影响,我们从SD大鼠中分离培养出原代软骨细胞,用梯度浓度的leptin（020ng/m L）刺激软骨细胞。结果显示,leptin能够显著降低软骨细胞中DUSP19 mRNA水平表达。体外用leptin（10ng/m L）刺激软骨细胞4h后能够显著诱导ROS产生,与阳性对照脂多糖（LPS）组一致。为明确leptin是以何种方式诱导软骨细胞产生ROS,我们用不同的ROS抑制剂预处理软骨细胞后再用leptin（10ng/m L）刺激。DCFH-DA染色后结果显示,相对于未处理组,NAC（ROS通用抑制剂）和鱼藤酮（RT,线粒体依赖性ROS抑制剂）均能显著抑制leptin诱导的软骨细胞ROS的产生,然而夹竹桃麻素（NADPH依赖性ROS抑制剂）和别嘌呤醇（黄嘌呤氧化酶依赖性ROS抑制剂）均不能显著抑制leptin诱导的软骨细胞ROS的产生。表明在软骨细胞中leptin是以线粒体依赖性方式诱导ROS产生。我们包装DUSP19过表达慢病毒,用leptin刺激软骨细胞后再加DUSP19慢病毒进行感染,结果显示DUSP19能够改善leptin诱导软骨细胞产生ROS。leptin在骨关节炎病理进行中具有怎样的作用机制呢?我们结果显示,相对于对照组,骨关节炎软骨组织中TLR4,MYD88,TRAF6和p-P65蛋白水平增加,表明TLR4/NF-κB信号通路在骨关节炎软骨组织中被活化,而注射NAC能够减弱TLR4,MYD88,TRAF6和p-P65蛋白表达水平,表明ROS抑制剂NAC能够减弱骨关节炎软骨组织中NF-κB信号通路活化程度。体外实验我们用不同浓度的leptin（0ng/m L、10ng/m L、20ng/m L）刺激软骨细胞,结果表明leptin能够增加TLR4,MYD88,TRAF6和p-P65蛋白表达水平,激活NF-κB信号通路,并且具有浓度依赖性。leptin是否是通过下调DUSP19表达诱导软骨细胞产生ROS进而活化NF-κB信号通路?我们结果显示,DUSP19及NAC均能减弱leptin对NF-κB信号通路的激活作用。qRT-PCR和ELISA结果显示,leptin（10ng/m）能够增加软骨细胞细胞因子表达及分泌,而DUSP19及NAC可改善leptin对软骨细胞细胞因子表达及分泌的诱导作用。我们用TLR4特异性siRNA转染软骨细胞以阻断NF-κB信号通路,定量PCR及ELISA结果显示,阻断NF-κB信号通路后能显著逆转leptin诱导的软骨细胞细胞因子IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-α的表达和分泌,表明leptin是通过激活NF-κB信号通路进而促进软骨细胞表达和分泌细胞因子,从而参与骨关节炎病理过程。二、leptin下调DUSP19表达激活MAPKs通路诱导软骨细胞凋亡为评估leptin对软骨细胞增殖的影响,我们将不同浓度的leptin（0ng/mL、5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L）分别刺激软骨细胞0h、12h、24h、48h、72h,CCK-8检测软骨细胞增殖情况,结果显示leptin能够以剂量依赖性的方式抑制软骨细胞增殖。为进一步证实leptin是否是通过阻滞细胞周期进而抑制软骨细胞增殖,Western blot结果显示leptin上调细胞周期调节蛋白p-Chk2、Chk2、p-Cdc25C、p-Cdc2、p27、cyclinD表达,下调Cdc25C和Cdc2表达。表明leptin通过调控G2/M期蛋白表达进而阻滞G2/M期抑制软骨细胞增殖。接着我们进一步证实leptin是否通过介导凋亡进而参与抑制软骨细胞增殖,Hoechst 33258和流式结果,相对于对照组,leptin能够以剂量依赖性的方式增加软骨细胞凋亡。Western blot结果显示,leptin能够显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加凋亡蛋白Bad及Bax的表达,此外leptin还显著激活caspase导致Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3剪切。表明leptin以caspase依赖性方式诱导软骨细胞凋亡。上述结果显示leptin可能通过影响软骨细胞增殖凋亡参与骨关节病理过程。调控细胞增殖凋亡最常见的两条信号通路是AKT信号和MAPKs号。因此本研究检测leptin是否对软骨细胞的AKT信号和MAPKs号的活化有影响。结果显示,相对于对照组,leptin不能引起AKT信号的活化,而能够激活MAPKs号。表明leptin可能是通过促进MAPKs活化影响软骨细胞凋亡进而造成骨关节炎退化。我们结果已经表明leptin能够激活软骨细胞MAPKs通路,因此我们推出leptin可能是通过激活MAPKs通路进而抑制软骨细胞增殖并促进其凋亡。Hoechst及CCK-8结果表明,MAPKs通路抑制剂均能逆转leptin对软骨细胞增殖的抑制作用,并且能够改善leptin对软骨细胞的促凋亡作用。Western blot结果显示,MAPKs通路抑制剂能够抑制凋亡蛋白Bad及Bax的表达,此外还能够抑制caspase活化导致Caspase-3剪切减少。表明MAPKs通路机制剂能够改善leptin对软骨细胞增殖的抑制作用,并能逆转leptin对软骨细胞的促凋亡作用。接着我们进一步证实leptin是否是通过调控DUSP19表达进而促进软骨细胞凋亡。Hoechst 33258结果显示,相对于leptin组,DUSP19及NAC能够逆转leptin对软骨细胞的促凋亡作用。Western blot结果显示,DUSP19及NAC能够降低凋亡蛋白Bad及Bax的表达,抑制caspase的活化,导致Caspase-8、Caspase-3剪切减少。此外DUSP19及NAC能够降低p38MAPK,ERK,JNK磷酸化水平,逆转leptin诱导的软骨细胞MAPKs路活化,提示DUSP19可能是通过降低MAPKs路活性进而改善leptin诱导的软骨细胞凋亡。骨关节炎模型动物结果显示leptin antigo能以剂量依赖性的方式降低骨关节炎软骨组织的凋亡百分比。Western blot结果显示leptin antigo及NAC能够增加骨关节炎软骨组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低凋亡蛋白Bad及Bax的表达,此外还可抑制caspase的活化。表明leptin antigo能够改善骨关节炎软骨组织凋亡,缓解骨关节炎退化,而leptin antigo改善骨关节炎退化可能是通过降低软骨组织中活性氧的产生。随后我们用Western blot检测软骨组织中MAPKs信号通路蛋白表达,Western blot结果显示相对于OA+PBS组,leptin antigo及NAC能够降低骨关节炎软骨组织中p-p38MAPK、p-ERK、p-JNK蛋白表达,表明leptin antigo能够逆转骨关节炎软骨组织中MAPKs信号通路活化,而这种逆转作用可能是通过上调DUSP19表达减少活性氧的产生进而降低骨关节炎软骨组织中MAPKs信号通路活化。为进一步证实MAPKs信号通路对软骨细胞的凋亡作用,我们在各组骨关节炎动物造模后4周分别注射MAPKs通路抑制剂,TUNEL组织细胞凋亡检测结果显示MAPKs三条信号通路抑制剂组均能逆转骨关节炎软骨细胞凋亡。此外Western blot结果显示MAPKs三条信号通路抑制剂均能够增加骨关节炎软骨组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低凋亡蛋白Bad及Bax的表达,此外还可抑制caspase的活化,导致Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3剪切减少。表明MAPKs三条信号通路抑制剂均能够改善骨关节炎软骨组织凋亡,缓解骨关节炎退化。