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目的:1.观察TNBS/乙醇诱导UC模型大鼠结肠黏膜炎性反应损伤时,骨髓来源BMSCs是否动员进入外周血液,进入外周血来源的BMSCs与骨髓来源的BMSCs,其生长增殖、迁移黏附的生物学特性有何不同,为探讨BMSCs归巢修复结肠黏膜奠定基础。2.探讨参苓白术散与痛泻要方促进TNBS/乙醇诱导UC模型骨髓中BMSCs动员及其对外周血来源的BMSCs与骨髓来源BMSCs的生长增殖、迁移黏附有何不同干预效应。同时,以“方证相应”理论为指导,通过二方的不同干预效应评价TNBS/乙醇诱导UC大鼠模型的中医证候特征。方法:1.180~220g健康SPF级SD雄性大鼠20只,常规饲养1周左右后,随机抽取6只作为空白组,剩余全部以三硝基苯磺酸(TNBS)/50%乙醇造成UC模型,5周后取结肠组织,采用HE染色进行模型成功的评价。2.依据参苓白术散与痛泻要方原方组成与剂量比例,采用传统的中药煎煮方法制备灌胃用药,从模型中随机选取2组给予参苓白术散与痛泻要方灌胃治疗,其他组给予等剂量生理盐水灌胃,28天后,麻醉大鼠,采集血液,分离股骨,收集空白组血清及参苓白术散组与痛泻要方组含药血清。提取外周血与骨髓中各组BMSCs进行原代培养,用倒置显微镜观察BMSCs形态,免疫荧光鉴定外周血与骨髓来源的BMSCs,流式细胞技术检测骨髓与外周血来源的BMSCs含量、生长、增殖。3.180-220g健康SPF级SD雄性大鼠20只,常规饲养1周后随机分2组,实验前禁食12-24h,各组大鼠给予参苓白术散与痛泻要方灌胃,第3次给药后2h在无菌的条件下腹主动脉采血、静置、离心、分离血清,混匀药物血清,水浴中灭活,冰箱保存(-20℃)备用。4.取各组外周血的BMSCs,用0.25%胰酶消化,按照1:2传代,取第三代BMSCs作为后续实验,RTCA检测各组来源的BMSCs的黏附能力、迁移及参苓白术散与痛泻要方含药血清的干预作用,用免疫组化法检测外周血来源的各组VCAM-1表达,QPCR检测外周血来源的各组VCAM-1表达,流式细胞技术检测外周血来源的各组VLA-4的表达。结果:1.骨髓及外周血来源的BMSCs动员检测。骨髓来源的各组阳性细胞百分数示:与空白组比较,模型组的阳性细胞百分数下降(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的阳性细胞百分数升高,痛泻要方组优于参苓白术散组(P<0.05),差异具有统计学意义;外周血来源的各组阳性细胞百分数示:与空白组比较,模型组的阳性细胞百分数升高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组阳性细胞百分数下降,痛泻要方组优于参苓白术散组(P<0.05),差异具有统计学意义。2.BMSCs的形态观察。细胞形态在刚刚接种时,主要表现为椭圆形、圆形不等的细胞。在培养液中,细胞密集地悬浮,细胞折光性比较强,培养3天后,部分细胞呈现类圆形或纺锤形,仍有大量未贴壁的细胞悬浮于培养液中。第一代细胞表现为:细胞贴壁生长,形态呈纺锤形、不规则形、三角形或多边形等多形态,细胞融合范围为80-90%,有较少的杂质悬浮于培养液中。3.RTCA检测骨髓与外周血来源的BMSCs的周期。骨髓来源的各组BMSCs细胞周期示:与空白组比较,模型组的S期细胞比例增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的S期细胞比例增高,痛泻要方组增高更显著(P<0.05),差异具有统计学意义;外周血来源的各组BMSCs细胞周期示:与空白组比较,模型组的S期细胞比例增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的S期细胞比例增高,痛泻要方组增高更显著(P<0.05),差异具有统计学意义。4.RTCA检测骨髓与外周血来源的BMSCs的增殖能力。骨髓来源的各组BMSCs,与空白组比较,模型组细胞活性增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散与痛泻要方组的细胞活性要高于模型组(P<0.05),差异具有统计学意义;而参苓白术散与痛泻要方组的细胞活性表现相当(P>0.05)。外周血来源的各组BMSCs,与空白组比较,模型组的细胞活性降低(P<0.05),模型组的细胞活性在四组中最低;与模型组比较,参苓白术散组与痛泻要方组的细胞活性高于模型组,痛泻要方组的细胞活性最高(P<0.05),差异具有统计学意义。5.RTCA检测外周血来源的BMSCs的黏附特性。与空白组比较,模型组细胞指数接近0(P>0.05);与模型组比较,随着时间的迁延,痛泻要方组发生黏附的细胞越来越多(P<0.05),差异具有统计学意义,而与参苓白术散组的关系比较弱(P>0.05)。6.QPCR、免疫组化检测外周血来源的各组VCAM-1的表达。与空白组比较,模型组的VCAM-1的表达增高(P<0.05),差异有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组VCAM-1的表达增高,痛泻要方组VCAM-1的表达增高更为显著(P<0.05),差异具有统计学意义。免疫组化染色显示VCAM-1的表达阳性为棕色的不规则形状,在各组均可检测到。7.流式细胞技术测示外周血来源的VLA-4的表达。外周血来源的VLA-4的表达示:与空白组比较,模型组的VLA-4的表达增高(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组、痛泻要方组的VLA-4的表达增高,痛泻要方组的VLA-4的表达增高更为显著(P<0.05),差异具有统计学意义。8.RTCA检测外周血来源各组BMSCs的迁移能力。外周血来源的各组BMSCs,与空白组比较,模型组CI增多(P<0.05),差异具有统计学意义;与模型组比较,参苓白术散组与痛泻要方组CI增多,痛泻要方组CI增多高于参苓白术散组(P<0.05),差异具有统计学意义。结论:1.在UC的过程中,骨髓来源BMSCs动员进入外周血,参苓白术散与痛泻要方均具有促进骨髓来源BMSCs增多,外周血来源BMSCs减少作用,痛泻要方组优于参苓白术散组。2.在UC发病过程中,骨髓与外周血来源的BMSCs的都具有一定的生长能力,参苓白术散与痛泻要方能够促进骨髓与外周血来源的BMSCs的生长,痛泻要方组优于参苓白术散组。3.在UC发病过程中,骨髓来源的BMSCs具有显著的增殖能力,而外周血来源的BMSCs无明显的增殖能力。参苓白术散与痛泻要方对骨髓及外周血来源的BMSCs增殖作用均有显著的促进作用,对骨髓来源BMSCs增殖的促进作用无明显差异,而对外周血来源BMSCs增殖的促进作用痛泻要方优于参苓白术散。4.痛泻要方能够促进UC大鼠外周血来源的BMSCs的黏附能力,与时间呈正相关,而BMSCs的黏附能力与参苓白术散无显著差异。另外,参苓白术散与痛泻要方具有促进UC大鼠外周血来源的BMSCs的迁移作用,痛泻要方优于参苓白术散。5.参苓白术散与痛泻要方能够促进UC大鼠外周血来源BMSCs的VCAM-1、VLA-4的表达,痛泻要方组优于参苓白术散组。