背景及目的：胃癌是世界上癌症死亡的第二大原因,是我国常见的恶性肿瘤,尤其在喜食腌制食品的西南地区,如何做到早期诊断早期手术是决定患者预后的重要因素。就进展期、术后复发及耐药的患者而言,放化疗效果不佳且毒副作用大,匮乏有效的治疗。所以寻找早癌诊断的特异性分子标志物及低毒有效的治疗是一件很迫切的事情。表观遗传学的研究为肿瘤带来了新颖而有效的诊治。胃癌的发生发展涉及多条信号通路(如WNT/β-catenin、P53等信号通路)的调控异常,与癌基因的激活、抑癌基因的失活有关。其中抑癌基因启动子CpG岛超甲基化导致基因沉默是抑癌基因除突变和缺失之外,引起抑癌基因失活的重要机制。研究证实抑癌基因启动子CpG岛超甲基化及其表达沉默是胃癌发生的频繁事件及早期事件。它具有肿瘤的特异性；组织特异性；还具有可逆性,用5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-CdR)等甲基转换酶抑制剂去甲基治疗后可恢复抑癌基因的活性,发挥抑制胃癌发生发展转移的作用,因而也成为新颖的胃癌治疗的靶点。故寻找和鉴定新的因启动子CpG岛甲基化而表达沉默的抑癌基因,以此作为胃癌特异性的分子生物学诊断指标及治疗靶点是很有价值和前景的。近来,研究发现胃癌中存在多个抑癌基因的启动子CpG岛超甲基化及其表达沉默,其中包括WNT拮抗剂DKK3及新发现的候选基因MSX1基因。本文关注的是在喜食腌制辛辣食物的西南地区是否也存在MSX1和DKK3基因启动子CpG岛的超甲基化及表达沉默,它们能否成为胃癌治疗的靶点。由于抑癌基因启动子超甲基化的可逆性,Decitabine(5-氮杂脱氧胞苷)因可逆转抑癌基因CpG岛超甲基化,恢复抑癌基因的功能,临床上已用于骨髓增生异常综合症、白血病的治疗。但由于5-aza-CdR的毒副作用较大,而且对正常细胞和癌细胞均有广泛的去甲基化作用,缺乏特异性的阻断效应,造成整个基因组的不稳定,从而限制它在临床的广泛应用。因此,我们的目标是寻找低毒有效且特异性针对肿瘤去甲基化的药物。这时,我们重新审视了槲皮素的抑癌作用及其机制。槲皮素富含于蔬菜、水果及中草药中,具有广泛的生理及药理活性。临床上因其降脂扩冠等作用已被作为心血管药物广泛应用,迄今为止,尚未见槲皮素在临床上有致癌的报道。已有多篇文献提到槲皮素对肿瘤的化学预防及治疗作用,我们之前也报道了槲皮素具有抑制胃癌生长及诱导胃癌凋亡的作用,原因与下调WNT的下游靶基因(PCNA,VEGF, HSP70)及MTP53有关。目前有少数几篇文献提到槲皮素具有逆转膀胱癌及结肠癌中抑癌基因启动子CpG岛甲基化的作用,提示槲皮素的抑癌机制与表观遗传学有关。已知胃癌WNT信号通路上游的拮抗剂DKK3及新发现的MSX1基因均存在启动子超甲基化及其表达沉默。而之前文献报道,恢复MSX1基因的表达则可诱导WNT上游拮抗剂DKK3、sFRP基因及下调CyclinD1等WNT下游靶基因的表达,提示MSX1的抑癌基因功能与抑制WNT信号通路有关。结合槲皮素的去甲基化治疗作用,我们设想槲皮素抑制胃癌的机制是否与逆转MSX1及DKK3的超甲基化有关,是否从WNT信号通路的上游就抑制其异常激活。如果相关,将进一步探讨槲皮素对WNT信号通路相关组分的影响,为揭示槲皮素新颖的抗癌机制,并为其作为低毒有效的抗癌药应用于临床提供一定的理论依据。研究目的：了解胃癌中新出现的候选抑癌基因MSX1基因与经典WNT拮抗剂DKK3基因的启动子甲基状态与其转录活性的关系；探讨槲皮素逆转WNT拮抗剂MSX1及DKK3基因启动子甲基化状态影响WNT通路抑制胃癌的作用及其机制。方法：1、RT-PCR检测5-aza-CdR处理前后MSX1及DKK3基因mRNA表达；2、MSP分析12例胃癌及癌旁组织、四例胃癌细胞株MSX1、DKK3启动子甲基化状态；3、CKK8检测了解不同浓度的槲皮素对胃癌细胞的生长抑制作用；4、建立胃癌皮下移植瘤裸鼠模型,每周两次给药,共28天,做出槲皮素对肿瘤的生长抑制曲线；5、提取胃癌细胞及组织的RNA,分析槲皮素作用前后MSX1,DKK3基因转录活性的变化；6、提取胃癌组织及细胞的DNA,分析槲皮素作用前后MSX1, DKK3基因甲基状态的变化；7、Western blot及免疫组化检测检查槲皮素对胃癌细胞WNT(β-catenin、 cyclinD1)蛋白表达的影响结果：1、RT-PCR检测显示四株胃癌细胞株MSX1、DKK3mRNA表达下达,5-aza-CdR作用后上述基因mRNA的表达上调；MSP分析提示体内外胃癌MSX1、DKK3基因均存在启动子CpG岛甲基化；而且与癌旁组织相比,胃癌组织中MSX1、DKK3基因启动子CpG岛甲基化有显著的差异性。2、槲皮素可抑制体外胃癌细胞生长,槲皮素对SGC-7901作用48小时IC50是19μmol/L;槲皮素在体内可抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长,50mg/kg作用28天抑制率为55%。3、RT-PCR显示槲皮素可上调体内外胃癌MSX1及DKK3基因mRNA的表达。4, MSP证实槲皮素可逆转体内外胃癌组织中MSX1及DKK3基因启动子甲基化的状态。5、Western blot及免疫组化证实槲皮素可下调CyclinD1蛋白的表达,使β-catenin蛋白表达下调,抑制β-catenin由胞膜转位到胞核。结论：1、胃癌中MSX1及DKK3基因的表达沉默与其基因启动子CpG岛的甲基化状态有关；与癌旁正常组织相比,胃癌组织MSX1及DKK3基因的甲基化具有肿瘤的特异性；而5-aza-CdR去甲基化处理后可上调MSX1及DKK3基因的表达；说明它是一个理想的治疗肿瘤的靶点。2、槲皮素可抑制体内外胃癌的生长,原因于：它逆转抑癌因MS1X1及DKK3基因启动子的甲基化,而恢复了抑癌基因的功能,从WNT信号通路的上游开始抑制其异常激活。其次,槲皮素还可下调并抑制P-catenin的转位使其稳定下来；可抑制WNT下游靶基因cyclinD1的表达,从而使胃癌细胞生长停滞。展望：如果条件许可,作为一个新出现的MSX1基因,我们可以进一步在大样本的临床标本中了解MSX1在癌前病变及胃癌组织中表达的差别,研究它是否是一个早期的肿瘤分子标志物；并进一步研究它作为抑癌基因的功能及其作用机制,这将是我们下一步的工作。