【摘 要】
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油菜是我国最重要的油料作物之一。油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）导致的一种世界性真菌病害,也是制约我国油菜高产、稳产、优质及安全生产的主要病害。目前,选育抗菌核病的油菜新品种仍是克服油菜菌核病的根本途径,但抗源匮乏及抗性遗传机制的复杂性等都极大地限制了抗病育种工作。因此,挖掘新基因应用于油菜抗病育种显得尤为重要。本课题组前期通过候选基因关联分析筛选到了抗病相
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油菜是我国最重要的油料作物之一。油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）导致的一种世界性真菌病害,也是制约我国油菜高产、稳产、优质及安全生产的主要病害。目前,选育抗菌核病的油菜新品种仍是克服油菜菌核病的根本途径,但抗源匮乏及抗性遗传机制的复杂性等都极大地限制了抗病育种工作。因此,挖掘新基因应用于油菜抗病育种显得尤为重要。本课题组前期通过候选基因关联分析筛选到了抗病相关基因BnGLIP1.C07,并在拟南芥中对该基因的功能进行了初步验证。本研究以BnGLIP1.C07过表达、RNAi抑制表达、CRISPR/Cas9敲除油菜为材料,继续验证该基因及关键SNPs位点对菌核病抗性的影响,筛选和鉴定上游互作转录因子及其参与的抗病信号调控网络,为油菜抗病分子育种提供理论基础和有应用潜力的候选基因。研究结果如下:1、为了验证BnGLIP1.C07基因在油菜菌核病抗性中的作用,我们首先利用甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系进行BnGLIP1.C07过表达、RNAi抑制表达株系的创建并对其T2代进行抗性表型分析。结果表明与野生型相比,核盘菌侵染后BnGLIP1.C07过表达株系抑制了核盘菌的生长及细胞死亡,显著增强了植株对核盘菌的抗性;而干扰株系则增强了其感病性。为了进一步验证BnGLIP1.C07在增强油菜对菌核病的抗性中作用,我们继续利用甘蓝型油菜下胚轴遗传转化体系进行BnGLIP1.C07 CRISPR/Cas9敲除株系的创建,获得CRISPR/Cas9敲除突变体植株并对T2代进行核盘菌接种处理,发现与野生型相比,敲除突变体更感病。2、为了深入研究BnGLIP1.C07基因参与油菜菌核病抗性的调控机理,我们进行了BnGLIP1.C07启动子分析及上游互作转录因子的筛选和鉴定。首先通过对启动子ProBnGLIP1.C07的克隆及核心转录元件的生物信息学分析,筛选到许多与转录及抗病相关的motif元件。构建了启动子驱动GUS报告基因的表达载体ProBnGLIP1:GUS并转入拟南芥中,GUS染色表明该基因在拟南芥根、茎、叶均有表达。对融合了ProBnGLIP1:GUS的拟南芥转化株系进行核盘菌及激素处理,发现GUS可以被核盘菌、ABA、Me JA及ACC诱导表达。通过酵母单杂交技术筛选与启动子ProBnGLIP1核心转录motif相结合的转录因子,结合高通量测序,得到了三个潜在的候选转录因子bZIP44、WRKY15及RAP2-3,并进一步通过酵母单杂交点对点实验验证了这三个转录因子与ProBnGLIP1.C07存在着互作关系。3、为了探究核盘菌侵染后BnGLIP1.C07介导的脂质组成及脂类分子的改变,我们利用非靶向脂质组学分析平台,比较筛选了在核盘菌侵染后,野生型分别与BnGLIP1.C07基因过表达转化株以及CRISPR/Cas9敲除株系的差异代谢物,发现这些差异代谢物多为甘油磷脂类、甘油脂类、鞘脂类等。通过KEGG富集分析发现核盘菌侵染后BnGLIP1.C07基因所影响甘蓝型油菜脂质代谢的途径主要有自噬-其他、糖基磷脂酰肌醇-锚生物合成（GPI-AP）、甘油磷脂和甘油脂类代谢途径等。4、前期通过对BnGLIP1.C07中功能SNPs进行分析,推测位于BnGLIP1.C07外显子并引起非同义取代的三个SNPs A/G、C/G及C/T可能是影响菌核病抗性的重要变异位点。因此,我们使用了两种单碱基编辑系统CBE及pTF101-BE通过油菜下胚轴遗传转化技术转入甘蓝型油菜中并获得了部分阳性转化株。
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