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背景及目的:肿瘤相关中性粒细胞(Tumor-associated neutrophils,TAN)能分泌多种趋化因子和细胞因子,影响肿瘤微环境中其他免疫细胞募集和活化,从而发挥促肿瘤或抗肿瘤作用。中性粒细胞表型及功能受到肿瘤微环境调节,但肿瘤微环境中的TRAP能否调节中性粒细胞相关分子表达及其机制尚未完全清楚。课题组前期研究发现:肿瘤细胞释放自噬小体(Tumor cell-released Autophagosome,TRAP)能够诱导B细胞/巨噬细胞成为具有免疫抑制功能的Breg/M2细胞。本文拟探讨:TRAP对小鼠中性粒细胞相关分子表达的调节作用;TRAP诱导小鼠中性粒细胞产生CCL2的机制及其对巨噬细胞趋化和表型的影响。方法:1.TRAP诱导小鼠中性粒细胞CCL2和IL-10产生的检测1)通过磁珠分选法获得小鼠骨髓中性粒细胞并用流式细胞术鉴定纯度;通过差速离心法提取肿瘤细胞培养上清中的TRAP并用流式细胞术进行鉴定。2)将小鼠中性粒细胞与CFSE标记的TRAP共孵育,流式细胞术检测中性粒细胞吞噬TRAP的比例;将小鼠中性粒细胞与不同浓度TRAP共孵育12小时,或与3μg/m L TRAP共孵育不同时间,流式细胞术检测TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例。3)将小鼠中性粒细胞与TRAP共孵育,QRT-PCR法检测相关分子的表达情况;再将小鼠中性粒细胞与不同浓度TRAP共孵育,用QRT-PCR、ELISA和流式细胞术检测CCL2和IL-10的表达。2.TRAP诱导小鼠中性粒细胞CCL2产生的机制及其影响巨噬细胞趋化的实验研究1)将WT、TLR2-/-、TLR4-/-小鼠中性粒细胞与TRAP共孵育;或将小鼠中性粒细胞分别用PI3K、ERK和P38抑制剂预处理1小时后再与TRAP共孵育,用QRT-PCR、ELISA法检测CCL2的表达;将小鼠中性粒细胞与TRAP共孵育,依次在0、15、30、60、120分钟时收取细胞,Western Blot检测AKT、p-AKT、ERK、p-ERK以及GAPDH的蛋白表达情况。2)将巨噬细胞RAW264.7与TRAP诱导的中性粒细胞培养上清在Transwell小室中共培养,观察巨噬细胞趋化情况;再将CCL2封闭抗体及同型对照抗体分别加入到培养上清中,并用Transwell小室实验来检测巨噬细胞的趋化情况;构建B16F10肺转移小鼠模型,3周后观察小鼠肺组织中巨噬细胞的浸润情况。将TRAP诱导的中性粒细胞培养上清加入到骨髓来源巨噬细胞中培养细胞,用流式细胞术检测巨噬细胞CD206的表达情况。结果:1.TRAP诱导小鼠中性粒细胞CCL2和IL-10产生的检测1)磁珠分选法可以从小鼠骨髓中分离得到纯度高达99.4%的中性粒细胞;差速离心法可从Hepa1-6肿瘤细胞培养上清中提取到纯度大于84%的自噬小体。2)TRAP能被小鼠骨髓中性粒细胞吞噬,且在3小时时,吞噬比例达到77.3%;TRAP诱导小鼠骨髓中性粒细胞凋亡具有浓度和剂量依赖性;相较于自发凋亡,TRAP诱导小鼠中性粒细胞凋亡比例更高、增加幅度更快。3)TRAP处理后的小鼠中性粒细胞上调表达IL-10、CCL2、IL-12、ICAM-1、TNF-和IL-6,下调表达MMP9和IFN-β,其中IL-10和CCL2的变化最明显;随着TRAP浓度增加,小鼠中性粒细胞CCL2和IL-10的m RNA表达及蛋白含量都逐渐增加;流式检测发现TRAP诱导IL-10+小鼠中性粒细胞比例明显升高。2.TRAP诱导小鼠中性粒细胞CCL2产生的机制及其影响巨噬细胞趋化的实验研究1)TRAP能够诱导WT和TLR4-/-小鼠中性粒细胞CCL2的产生,而不能诱导TLR2-/-小鼠中性粒细胞CCL2的产生;PI3K及ERK抑制剂预处理中性粒细胞后TRAP诱导其CCL2 m RNA及蛋白表达都明显减少,而TRAP对P38抑制剂处理的中性粒细胞CCL2产生无明显影响;TRAP诱导小鼠骨髓中性粒细胞AKT和ERK信号通路发生明显磷酸化。2)TRAP诱导的小鼠中性粒细胞培养上清能够在体外促进巨噬细胞趋化及其CD206表达;用CCL2封闭抗体封闭培养上清中的CCL2能明显减少巨噬细胞趋化数量;体内实验结果表明,与PBS组和Neutrophils组相比,Neutrophils(TRAP)组的小鼠肺组织上巨噬细胞浸润明显增多。结论:1.TRAP能调节小鼠中性粒细胞相关分子的表达,并显著促进CCL2和IL-10的产生;2.TRAP通过与小鼠中性粒细胞表面的TLR2受体作用,激活PI3K/AKT、ERK信号通路,诱导CCL2的产生;TRAP诱导的小鼠中性粒细胞通过产生CCL2在体外促进巨噬细胞趋化;TRAP诱导的小鼠中性粒细胞在体内也能促进巨噬细胞趋化。