自然遗传转化现象是细胞自发建立感受态,摄取外源DNA整合到基因组或以质粒形式存在于染色体外,从而获得新的遗传性状的过程。自然遗传转化对于细菌获得新的遗传性状、适应复杂多变的自然环境和物种进化有着重要的意义。大肠杆菌作为模式生物材料被广泛应用于基础研究和应用中,而对于其自然转化能力的研究报道较少,且大多停留在现象层面,缺乏系统的相关调控机制研究。本课题组在前期的研究中发现,大肠杆菌培养至稳定期后经过开放静置培养可以建立自然感受态,并在琼脂平板上发生质粒DNA转化。对其机理的初步研究发现,大肠杆菌与其他细菌DNA摄取相关同源基因并不参与此转化过程,而普遍压力应答因子RpoS (σs)介导了自然遗传转化。这表明大肠杆菌自然遗传转化可能采取了一种新的感受态建立和DNA摄取机制。本研究以感受态诱导和平板压力因素作为出发点,探究了营养供给和氧化压力胁迫对自然遗传转化的作用,并对其机制做了深入研究。1.丰富营养条件有利于自然遗传转化进行。额外添加碳源可通过抑制cAMP-CRP,进而解抑制rpoS促进自然遗传转化。通过比较不同营养条件下转化频率发现,丰富营养条件比寡营养条件更利于大肠杆菌感受态的建立。在丰富培养基中额外添加0.2%可利用碳源(葡萄糖,果糖,海藻糖,甘露糖,甘露醇,N-乙酰葡萄糖胺,半乳糖,岩藻糖,麦芽糖,甘油,N-乙酰神经氨酸),转化频率提高了2.6倍至15.3倍,而额外添加氮源则无明显影响。通过比较不同时期添加碳源对转化的影响,确定了碳源作用时期为液体振荡培养阶段而非平板转化阶段。通过比较磷酸转移酶系统(PTS)相关基因缺失菌株自然遗传转化频率发现,其转化频率与野生型菌株相比有所提高。另外,在添加碳源的同时添加cAMP,自然遗传转化频率即可回复到对照水平。由于碳源代谢与PTS活性及胞内cAMP含量有着密切关系,因此碳源对转化的促进作用可能是转运和代谢过程中通过影响PTS活性,造成胞内cAMP含量下降导致的。通过研究crp和cyaA缺失菌株自然转化频率发现,两者均比野生型提高了近1个数量级,这表明转录调控子cAMP-CRP对自然遗传转化有显著抑制作用。因此,碳源对自然转化的促进作用是通过抑制cAMP-CRP实现的。cAMP-CRP对rpoS的调控作用存在争议,为了探究cAMP-CRP对自然遗传转化的作用是否与rpoS相关,本研究对其调控方式做了初步研究。首先,检测crp和cyaA缺失菌株中rpoS启动子活性和蛋白含量,结果证实cAMP-CRP对rpoS的调控具有双向性,即cAMP-CRP在对数早期对rpoS起负调控作用,对数中后期及稳定期起正调控作用。其次,对rpoS启动子附近的两个预测CRP位点进行突变,检测启动子活性和蛋白含量的变化,结果表明两个位点对rpoS的表达均为正调控作用,这暗示了cAMP-CRP在对数前期对rpoS的抑制作用是间接的。通过检测双敲除菌株ΔcrpΔrpoS和ΔcyaAΔrpoS自然遗传转化频率发现,敲除rpoS基因后crp和cyaA突变株对转化的促进作用消失,这表明rpoS在自然转化中起关键作用,crp和cyaA突变株对转化的促进作用是通过对数早期解抑制rpoS实现的。另外,研究发现在rpoS突变株中添加碳源,自然转化频率并没有显著影响。检测碳源对RpoS蛋白含量的影响,结果发现在添加各种碳源后,对数早期RpoS的含量均有明显提高,随后其含量相较于空白对照组又有所降低,这与cAMP-CRP对rpoS的双向性调控相一致。以上结果说明rpoS在对数早期的积累是碳源促进自然转化的重要原因。综合以上结论证实,碳源可以通过降低cAMP-CRP,进而在对数早期解抑制rpoS促进感受态的建立和自然遗传转化。2.氧化压力对自然遗传转化具有促进作用。活性氧分子协同胞内游离铁离子共同参与了对自然转化的促进作用。本研究对rpoS上下游相关基因、固体平板胁迫应答相关基因和其他相关基因进行了筛选。结果发现,氧化压力应答相关基因缺失导致自然遗传转化频率提高。其中,过氧化氢应答调控基因oxyR及其调控的过氧化氢酶Ⅰ基因katG缺失导致自然转化频率分别提高了6.6倍和3.6倍,rpoS调控的过氧化氢酶Ⅱ基因katE的缺失菌株也显示出高于野生型的自然转化频率。而超氧化物应答调控基因soxRS及其调控的超氧化物歧化酶基因sodA、sodB缺失则对转化没有明显影响。另外,在液体培养时期添加过氧化氢和超氧化物诱导剂,自然遗传转化频率提高了1个数量级左右,这说明活性氧分子特别是过氧化氢引起的胞内氧化压力对自然遗传转化有促进作用。进一步研究发现,在过氧化氢和超氧化物诱导之前添加铁离子螯合剂降低胞内游离铁离子,可以降低活性氧分子对转化的促进作用,说明活性氧分子和铁离子协同参与了对转化的促进作用。而活性氧分子与亚铁离子发生芬顿反应产生羟基自由基造成DNA损伤,可能是氧化压力诱导转化发生的原因。据报道,oxyR和soxRs基因参与了细胞从液体环境转移到平板的过程中受到的氧化压力胁迫应答。平板上添加过氧化氢酶可以回补oxyR突变株在平板上的生存缺陷现象,也证实了过氧化氢清除系统对于细胞对固体平板胁迫应答的重要性。然而在平板上添加过氧化氢或过氧化氢酶对自然遗传转化没有显著影响,这暗示了早期细胞产生的内源氧压力是诱导转化的主要原因。因此细胞内源氧和平板外源氧压力可能同时参与了对转化的促进过程。综上所述,本研究通过对感受态诱导和平板转化因素的研究,发现丰富营养条件和氧化压力对大肠杆菌自然遗传转化具有促进作用,并揭示了其相关作用机制。这对于深入了解营养状态和固相基质等环境因素与细菌自然遗传转化的关系有重要意义。碳源通过抑制cAMP-CRP对自然转化的促进作用机制与已报道的其它细菌转化机制不同,且氧化压力对自然转化的影响在其他菌种中未见报道,这暗示了大肠杆菌自然遗传转化采取了一种新的机制。综合目前得到的结论和线索推断,大肠杆菌自然遗传转化受到多种因素的共同调控。研究其调控机理有助于丰富人们对水平基因转移和物种进化的认识,为细菌耐药性和毒力基因的传播提供理论依据,为工程菌的生物安全性提供了指导。