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本文首次以免疫活性为筛选指标、用冻溶除胶法分离活性多糖,运用化学和色谱双重分析方法系统深入地研究了龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)活性多糖的提取优化、分离纯化以及粗多糖和均一多糖的化学组成、结构和活性。研究结果表明:
1、通过冻溶法得到龙须菜胶体多糖(NGF)和非胶体多糖(SGF),其中SGF的溶出率和多糖含量均显著高于NGF,但NGF的免疫活性极显著高于SGF(P<0.01);
2、不同提取水温对龙须菜非胶体粗多糖的得率影响显著(n=24,P<0.01),50℃水温提取时,龙须菜非胶体粗多糖的得率最高9.11±0.31%,蛋白含量最低仅为4.38±0.13%,当提取水温超过60℃时,非胶体粗多糖的得率显著下降;龙须菜非胶体粗多糖均表现出显著的体外免疫活性,其中50℃提取水温组的活性显著高于其它各温度组,各组没有表现出抗HSV-I型和II型病毒活性;各组非胶体粗多糖的3,6内醚半乳糖含量在15-20%之间,而半乳糖的含量则在30-40%之间,其中内醚半乳糖和半乳糖之和占已知总糖的90%以上,50℃提取水温组硫酸基含量略高于其它组。
3、对50℃水温提取条件进行了优化,发现提取次数对溶出率有着较大的影响,提取3次得率最高为13.63%,提取1次仅为7.63%,但提取次数、料水比和提取时间对非胶体粗多糖的多糖含量、蛋白含量、免疫活性均无显著影响,通过正交实验和结合实际生产能耗因素,确定最佳提取工艺为:提取水温为50℃,料水比为1:40(质量比),提取2次,每次浸提3小时。
4、用离子色谱法对NGF进行分离得到盐相(NGFS)和水相(NGFW),NGFS的得率、3,6内醚半乳糖和半乳糖含量分别为:51.10±4.10%、27.83±0.23%和62.10±1.88%显著高于水相的0.60±0.13%、17.98±0.23%和29.31±0.34%(P<0.01),水相的多糖种类、多糖含量、蛋白含量和免疫活性要高于盐相:从得率和纯度两方面考虑选择NGFS继续研究。
5、NGFS由50.3%的β-D-半乳糖,40.5%的3,6-内醚-α-L-半乳糖和9.2%的α-L-半乳糖-6-硫酸基组成,硫酸基的含量为10.32%。L/D的比率为1.01(β-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖+α-L-半乳糖-6-硫酸基),和琼脂糖的比率接近。结构为:→4-3,6-内醚-α-L-半乳糖(1→3)-β-D-半乳糖1→片断,α-L-半乳糖的C-6位可能被硫酸基取代。