论文部分内容阅读
前言
肌节同源盒基因同系物2(Muscle Segment Homeobox,Homolog of,2,Msx2)位于5号染色体长臂5q34-q35,编码由263个氨基酸组成的蛋白质,它可以与核心转录复合物作用调节转录。以往研究多集中在Msx2对颅骨、乳腺等组织发育的影响上,但最新研究发现Msx2基因表达异常可影响晶状体发育,导致小眼球畸形等多种先天性眼病。
晶状体作为眼屈光间质,具有屈光和调节的功能,实验证明在小鼠围产期移除晶状体会导致眼前节多组织发育障碍,晶状体功能不良也可直接导致视网膜等眼组织发育障碍,说明晶状体的发育在眼组织发育过程中所起的作用至关重要。晶状体形态发生可分三个阶段,包括晶状体的诱导和决定、晶状体形态发生及晶状体细胞分化。脊椎动物的晶状体来源于头部的表皮外胚层,最早的形态学表现是形成晶状体基板。晶状体基板是与视泡相邻的表皮外胚层增厚的区域,在视泡从前脑突出并与表皮外胚层紧密接触之后才形成晶状体基板。视泡与晶状体基板之间的相互作用很强,并有细胞质外延介导。在胚胎发育第10天,晶状体基板和视泡的外层内陷,形成晶状体凹和视杯。胚胎发育第11天,晶状体凹在表面外胚层闭合形成晶状体泡。在这个时期,晶状体凹面向视网膜一侧的上皮细胞开始增厚,晶状体泡后部的上皮细胞向前延伸分化成晶状体纤维细胞。
多年来国内外学者对晶状体发育过程以及其调控机制进行了大量研究。现阶段对于晶状体发育过程的调控,国内外学者主要从信号传导通路和转录调控两方面进行研究:1)信号传导通路:目前研究认为晶状体发育过程涉及BMP、FGF及Wnt等多种信号传导通路,对晶状体的发育起重要作用;2)转录调控:晶状体调节基因(Pax6,Meis,Six3等)和结构基因(Crystallins,MIP/aquaporin0等)的转录调控与晶状体发育全过程直接相关,在晶状体发育过程中形成不同时期不同位置的转录调控网络,是晶状体发育过程中最重要的调控途径。任何晶状体调节基因和结构基因的调控出现异常,都会导致晶状体发育异常。
最近研究发现Msx2表达异常可以影响晶状体发育过程,导致晶状体发育障碍。但Msx2作为新发现的眼部发育调控基因,其在眼部发育过程中的具体功能及作用机理尚不清楚。本研究利用Msx2基因敲除小鼠,通过观察其晶状体发育过程的变化,探讨Msx2基因表达缺失对晶状体早期发育的影响。
材料和方法
一、BrdU免疫组化分析:
利用Msx2基因敲除小鼠、B6小鼠,BrdU标记母鼠,制备胚胎发育10.5至14.5天的石蜡切片,常规苏木素.伊红染色(HE染色)观察Msx2基因敲除小鼠晶状体发育形态的变化,免疫组织化学方法观察Msx2基因敲除小鼠晶状体内BrdU标记细胞的变化。
二、原位分子杂交:
观察Msx2基因敲除小鼠晶状体内Pax6、Six3、Prox1、Mab21L1、Mab21L2、Sox2、PitX3、Mip、FoxE3的转录变化。以含有KNA聚合酶启动子的cDNA质粒为模板,利用RNA聚合酶转录生成RNA探针。取小鼠胚胎制取冰冻切片,原位分子杂交观察Msx2基因敲除小鼠晶状体内Pax6、Six3、Prox1、Mab21L1、Mab21L2、Sox2、PitX3、Mip、FoxE3的转录变化。
三、Real time RT-PCR定量分析FoxE3转录变化:
将pEGFP-Msx2,pEGFP-C1利用脂质体转染至alpha-TN4鼠晶状体上皮细胞内,Trizol-Reagent提取细胞内RNA,使用Super Script Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒,反转录获得cDNA文库。以不同的cDNA为模板,加入FoxE3正反引物及real-time PCR试剂盒内的酶预混液及水,以beta-actin为组间对照进行实时定量PCR。
四、FOXE3启动子分析:
以小鼠基因组DNA为模板,PCR方法扩增出不同长度的FoxE3启动子片段,连接至pDRIVE Vector上,提取目标质粒DNA。选择DNA序列无突变及错位的克隆质粒,用DNA核酸内切酶mluI,XhoI双酶切,再利用T4DNA Ligase将启动子片段克隆至真核表达载体pGL-3 Basic中,构建不同长度含荧光素酶编码序列及FoxE3启动子的质粒。利用脂质体将含不同长度的FoxE3启动子质粒、pEGFP-Msx2、pDPIVE质粒、空白载体及pCMV-Pax6、pCMV-sip1共同转染至鼠晶状体上皮细胞alpha-TN4细胞内。测定荧光素酶活性及LacZ报告基因的活性,记录数值,对两组数值进行统计分析。
结果
从E10.5天开始,Msx2基因敲除小鼠的晶状体发育过程与杂合子小鼠相比受到抑制,表现为晶状体泡发育位置正常但体积变小,同时视网膜增厚。至E12.5天,Msx2基因敲除小鼠晶状体上皮细胞分化不明显,晶状体明显减小,并且晶状体与角膜粘连,不分离。晶状体与视网膜之间有神经鞘细胞长入,将晶状体向前推,晶状体泡位置前移。在胚胎发育第11.5天,Msx2基因敲除小鼠与对照组相比,BrdU标记细胞的数量明显减少,统计学分析表明两种小鼠BrdU标记细胞的比例有统计学差异。
原位分子杂交技术观察到在胚胎E10.5天时,Msx2基因敲除小鼠的晶状体中可观察到FoxE3在晶状体内表达水平下降,至E12.5天,FoxE3的表达完全缺失,而Msx2杂合子小鼠中FoxE3在E10.5-12.5天的晶状体前部上皮细胞中明显表达。胚胎10.5至12.5天,同Msx2杂合子小鼠相比,Msx2基因敲除小鼠晶状体中Prox1的表达水平升高。胚胎10.5至12.5天,同Msx2杂合子小鼠相比,Msx2基因敲除小鼠视网膜中Sox2的表达缺失。而胚胎10.5天之后,Msx2杂合子小鼠及基因敲除小鼠中Sox2在晶状体内无表达。其他晶状体发育过程中关键的转录调控因子Pax6、Mab21L1、Mab21L2、PitX3的表达在Msx2基因敲除小鼠及杂合子小鼠中无差异、Mip作为晶状体发育的结构蛋白,在两种小鼠中的表达无明显差异。
当鼠晶状体上皮细胞瞬时转染pEGFP-Msx2及空白对照的pEGFP-C1后,转染Msx2的晶状体上皮细胞内FoxE3的表达在第23个扩增周期时达到标准水平,而空白对照组晶状体上皮细胞内FoxE3的RNA表达在第38个扩增周期达到标准水平,统计分析结果显示转染Msx2后,FoxE3的表达量提高了77.5倍。
对Msx2及不同长度的FoxE3启动子共同转染鼠晶状体上皮细胞后,荧光素酶活性及lacZ报告基因活性测定,发现当sip1、smad5结合物及Pax6共同结合于FoxE3启动子,作用于FoxE3启动子的启动子及远端增强子序列,可以促进FoxE3的转录。
结论一、Msx2基因敲除小鼠晶状体发育异常,表现为无晶状体或小晶状体,晶状体与角膜组织分离迟缓。
二、Msx2基因敲除后,影响了晶状体细胞的细胞周期,抑制晶状体上皮细胞离开细胞周期,进行细胞分化。
三、胚胎发育10.5-12.5天,Msx2基因敲除小鼠晶状体中FoxE3表达水平下降直至缺失。
四、胚胎发育10.5-12.5天,Msx2基因敲除小鼠晶状体中Prox1表达水平上调。
五、胚胎发育10.5-12.5天,Msx2基因敲除小鼠视网膜中Sox2表达缺失。
六、Msx2基因敲除后可通过抑制FoxE3基因的表达,上调Prox1的表达来调控晶状体发育,Msx2不仅参与晶状体发育的转录调控,而且在转录调控网络中处于上游位置,在晶状体发育过程中起到重要的作用。
七、实时定量PCR分析证明了Msx2对FoxE3的转录有明显促进的作用,Msx2通过调控FoxE3的转录来调控晶状体发育。
八、Msx2对FoxE3的转录调节机制之一是通过与sip1、smad5及Pax6结合,作用于FoxE3启动子的远端序列,增强FoxE3的转录。