研究背景与目的标记免疫学,就是将标记技术和免疫学技术相结合进行分析测定的一门学科,是集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科,其基本原理是通过荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原,将抗原抗体反应的高度特异性与各标记物的高灵敏、可测量性相结合,以检查体内各种生物活性物质的活性和浓度。常用的标记免疫学分析方法包括免疫荧光、酶免疫测定、免疫组化、放射免疫测定、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫等。随着标记技术、单克隆抗体技术和分子生物学技术的不断发展与完善,标记免疫学已广泛应用于医学、农业、环境及食品检测等多个领域。根据抗原抗体反应时,待测物是否均匀分散在液相体系中,可以将免疫分析技术分为均相免疫分析和非均相免疫分析。当中,常用的均相免疫分析方法有AlphaScreen、TRACE、 LANCE。目前国内外广泛应用于临床的免疫诊断主要是传统的非均相分析,例如ELISA、快速试纸条法等。一般而言,传统非均相分析的操作步骤繁琐、免疫反应体系缓慢、需要通过洗涤来分离结合的与未结合的抗原或抗体、耗费时间长、不易自动化等缺点。与之相比,均相免疫分析技术因为省却了洗涤的步骤,可以减少操作带来的误差,通常具有灵敏度高、背景荧光值低、信噪比高、应用范围广、性质稳定、便于操作、易于微型化自动化等优点。甲胎蛋白(a-fetoprotein, AFP)又称甲种胎儿球蛋白,人类的甲胎蛋白是由4号染色体长臂的AFP基因所编码的一种单链多肽糖蛋白。甲胎蛋白是主要在胎儿发育过程中,由卵黄囊和肝脏分泌,并经由肾脏排入尿液和羊水,并通过胎盘进入母体血液之中的白蛋白。甲胎蛋白的浓度峰值出现在胎儿时期,之后在8至12个月逐渐降低,并降至健康成人水平。正常情况下,甲胎蛋白浓度维持在低水平。如果母体血清或羊水中甲胎蛋白的浓度异常,提示胎儿可能发育异常,比如神经管缺损、肠道闭锁、先天性肾病变、胎儿窘迫、死胎等。因此,虽然甲胎蛋白是一项非特异性指标,但母体血清或羊水的中甲胎蛋白浓度依然可以作为胎儿畸形的筛选指标。临床上还常联合其他检测指标,将其应用于出生缺陷的产前筛查和诊断,以期对疾病实现早发现、早干预,有助于减少死亡率、提高存活率和大力普及优生优育。另外,由于肝细胞癌、卵黄囊和胚胎性肿瘤及部分肝外肿瘤患者可重新合成甲胎蛋白,诸多肝病皆可以伴有甲胎蛋白浓度的升高,因此甲胎蛋白常用于原发性肝癌或是其他非肝癌恶性肿瘤,包括消化、呼吸、泌尿生殖等多系统器官恶性肿瘤的临床辅助检测指标。其次,甲胎蛋白还常用于肝炎、肝硬化等急慢性肝病诊断、病理变化和病程预后的监测。量子点(Quantum Dots, QDs)是一种把粒子在三个空间方向上限制束缚住的具有量子限域效应的半导体纳米结构材料。它具有较宽激发谱、窄而对称的发射峰、抗光漂白性、Stokes位移大、较高量子产率、摩尔消光系数大等诸多光学特性,使之有望成为新型的荧光标记物用于现代均相免疫分析技术中。氧通道技术(Luminescent oxygen channeling assay, LOCI)是均相免疫分析方法的一种,其特点是感光微球被激发光激发后的,能把周边溶液中的氧分子变成高能的单线态氧,并以此为载体进行信号传递,与传统的非均相免疫分析相比,省去洗涤的步骤,能有更高的灵敏度。研究内容与方法本文旨在利用脂溶性的半导体量子点纳米材料,构建功能性发光微球,结合高能氧通道技术,在荧光共振能量转移的原理下,以甲胎蛋白为例,建立一种新型的基于量子点的高能氧通道均相荧光免疫分析方法并探索其初步应用。主要的研究工作包括以下几个方面：1.发光微球的构建与表面化学修饰：本研究通过化学溶剂生长法合成出具有核／壳结构的硒化镉／硫化锌脂溶性量子点和能接收单线态氧的噻嗪化合物1-苯胺基,2-苯基氧硫杂环己烯(N,N-dimethyl-4-(2-phenyl-5,6-dihydro-1,4-oxathiin-3-yl)benzenamine, thioxene).然后通过有机溶剂溶胀法,把量子点、噻嗪化合物和天线材料9,10-双(苯乙炔基)蒽(9,10-Bis (phenylethynyl) anthracene, BPEA)包埋在羧基化聚苯乙烯微球里,构建量子点发光微球,并通过化学修饰降低其表面非特异性吸附,同时在交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide, EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide, Sulfo-NHS)的作用下把抗甲胎蛋白的一株单克隆抗体E014,通过羧基与氨基的脱水缩合成肽反应,将其偶联在发光微球表面,构建功能性量子点发光微球。2.感光微球的构建与表面修饰：本研究合成光敏性材料BTHS酞青化合物(二(三己基硅氧基)-2,9,16,23-四正丁基-29,31-二氢酞青-硅烷),并通过热溶胀法包埋在聚苯乙烯微球内,构建成感光微球。然后同样对感光微球表面进行化学修饰以降低其非特异吸附性,并在EDC、Sulfo-NHS的作用下与链霉亲和素(Streptavidin, Sav)相偶联,构建功能性感光微球。3.免疫检测：用生物素标记抗甲胎蛋白的另一株单克隆抗体E010,通过生物素-链霉亲和素系统,双抗体夹心法,荧光共振能量转移,构建免疫检测方法。用标准品缓冲液将AFP抗原配制成0 IU/mL.1 IU/mL、10 IU/mL、100 IU/mL、500 IU/mL、1000 IU/mL系列浓度,用分析缓冲液把功能性感光微球、发光微球的浓度调整为0.1 mg/mL。用生物素标记AFP的另一株单克隆抗体E010,并调整浓度为5 μg/mL。把25μL的发光微球、AFP抗原、生物素化抗体混合,37℃震荡孵育15分钟后,避光,加入175 μL感光微球,37℃继续孵育15分钟后,用680nm的光源激发感光微球,检测605nm处的荧光信号强度。并以自制试剂中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理后绘制标准曲线。4.实验的优化：具体包括发光微球包埋条件的优化、发光微球选用天线材料的优化、发光微球上样量、免疫反应时间的优化等。研究结果采用双抗体夹心法,两株单克隆抗体与AFP抗原形成抗原抗体免疫复合物,并拉近观光微球和发光微球的距离,实现单线态氧的传递,经过荧光共振能量转移,使量子点发射信号荧光。通过检测量子点的荧光信号,发现其信号强度与反应体系中AFP抗原浓度呈线性相关,其工作曲线为LogY=2.401+1.052-LogX (R2=0.959,P<0.01),分析灵敏度为2.65 IU/mL。该新型均相免疫分析方法不需冲洗掉未结合的荧光标记物,灵敏度高,可为今后实现快速、多元、高灵敏度、微量化、自动化及高通量化的现代免疫分析技术提供科学依据。研究结论本文通过把量子点溶胀包埋进羧基化聚苯乙烯微球制备而成的发光微球与抗AFP的一株单克隆抗体偶联,制备得功能性的发光微球；合成光敏性的BTHS酞青化合物并包埋进聚苯乙烯微球制得感光微球,并与链霉亲和素偶联；把抗AFP的另一株单克隆抗体与生物素相连后,通过生物素-链霉亲和素系统,建立一种基于量子点的高能氧通道均相荧光免疫分析方法。