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由黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病是影响水稻生产的重要病害之一,严重制约水稻高产和稳产。水稻与Xoo的互作是研究植物与病原物互作的模式系统之一。寄主植物水稻(粳稻品种日本晴和籼稻品种93-11等)和病原菌Xoo(韩国菌株KACC10331、日本菌株MAFF311018和菲律宾菌株PXO99A等)的全基因组测序已经完成,为深入研究水稻与Xoo的互作奠定了生物信息基础。本实验室前期利用EZ-Tn5转座系统,构建了白叶枯病原菌PXO99A的突变体库,通过筛选PXO99A的突变体库,获得14个使CBB23感病的突变菌株。在此基础上,对这14个突变菌株的Tn5插入位点进行侧翼序列分析,发现有3个菌株Tn5插入在TALE(Transcription activator-like effectors)类基因的位置,这3个菌株分别命名为P99M2、P99M4和P99M5。本论文分为两部分:第一部分是克隆与水稻白叶枯病广谱抗病基因Xa23对应的无毒基因avr Xa23;第二部分是筛选水稻中与Avr Xa23互作的蛋白,并对相关蛋白及其编码基因进行功能分析。获得的主要结果如下:1.通过筛选PXO99A的Cosmid基因组文库,获得34个含有TALE类基因的Cosmid质粒(简称C1-C34)。将这34个Cosmid质粒转化到突变体菌P99M5中,发现C15转化进入P99M5后能够激发CBB23的抗病性,说明C15含有与Xa23基因对应的无毒基因。2.经过测序分析,发现C15中含有tal C9a和tal C9b两个候选的无毒基因。构建tal C9a和tal C9b的表达载体,分别命名为p HM1-Mi和p HM1-L。p HM1-L转化进入P99M5等突变体菌中能够使CBB23抗病,而p HM1-Mi无此功能。说明tal C9b是与Xa23相对应的Xoo无毒基因avr Xa23。3.avr Xa23是TALE类基因,全长4452bp,编码蛋白含1483氨基酸。通过Southern blot方法,证实avr Xa23存在于国内外Xoo代表性菌株中。Avr Xa23可以激活水稻中抗病基因Xa23的表达,avr Xa23的广泛存在可以解释Xa23对于白叶枯病菌的广谱抗病性。4.构建PXO99A诱导CBB23的c DNA文库。以Avr Xa23为诱饵,筛选该c DNA文库,初筛获得323个侯选克隆。通过测序后排除移码、复筛进一步验证获得43个候选阳性克隆。这43个克隆编码26种蛋白质,其中7个可能与抗病相关。将这7个基因的c DNA全长扩增并构建成prey载体进行酵母双杂交验证,然后进行GST pull-down体外验证,最终证明3个水稻蛋白质(Os IMPα、Os THIC和Os THI1)与Avr Xa23互作。5.生物信息学分析表明,Os IMPα为核转运蛋白,可能辅助Avr Xa23进入细胞核;Os THIC为嘧啶环前体合成酶,Os THI1为噻唑合成酶,两者都是维生素B1合成的关键酶。维生素B1作为植物抗病反应的激活剂,通过水杨酸和Ca2+相关的信号途径,使植物产生系统获得性抗性,对水稻抵抗Xoo的侵染具有重要作用。6.进一步的实验研究发现,Os THI1与Avr Xa23的N端互作;Os THI1定位在叶绿体上;利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻近等基因系CBB4(含Xa4,抗白叶枯病原菌PXO61)中的Os THI1,获得的转基因植株叶片维生素B1含量下降,且对PXO61感病。总之,本研究成功克隆到对应于Xa23的无毒基因avr Xa23,该无毒基因广泛存在于检测的所有Xoo生理小种中,解释了Xa23对白叶枯病菌的广谱抗病机理。筛选到水稻中与Avr Xa23互作的3个蛋白:核转运蛋白Os IMPα以及参与维生素B1合成的Os THIC和Os THI1。维生素B1对水稻的获得性抗性很重要,我们推测在缺少Xa23基因的水稻中,Avr Xa23可能通过结合维生素B1合成酶Os THIC和Os THI1,抑制水稻的抗性。