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结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)是引起结核病的病原菌,结核病的早期诊断对合理治疗和终止传染具有重要作用。目前应用的PCR、荧光定量PCR(Fluorescence Quantitive PCR,FQ-PCR)、环介导等温扩增法(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)等分子生物学检测法是以MTB-DNA为靶序列设计引物并进行扩增的,以DNA为基础的引物检测法对死菌或活菌都呈现阳性结果,在临床上无法评估抗结核治疗效果,并且检测灵敏度和特异性有限,不能满足临床诊断的需要。MTB-DNA通常为单一或少数拷贝,而16S rRNA在一个活的MTB中最高可达10~4拷贝,因此检测16S rRNA可提高检测的灵敏度;同时,结核杆菌16S rRNA仅存在于代谢增殖的活菌中,因而检测16S rRNA不但可提高诊断灵敏性,还可以用来评估抗结核疗效;此外,LAMP技术设备廉价、操作简便,产物无需任何仪器观察,经钙黄绿素或羟基萘酚蓝等染色后,肉眼可见,扩增快速高效,适合各种条件下检测,尤其适用于基层及现场使用。本研究针对16S rRNA区段设计MTB引物,建立逆转录-环介导等温扩增技术(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)用以检测MTB,为结核病的临床诊断提供技术支持。第一部分应用逆转录-环介导等温扩增技术检测痰液中结核分枝杆菌16S rRNA目的:通过在结核分枝杆菌16S rRNA区段设计引物,建立RT-LAMP检测技术,为结核病的快速检测提供一个灵敏度高、特异性强、可检测活菌的简便的方法。方法:将MTB的16S rRNA完整序列与非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)进行比较,用Primer Explorer V5软件设计引物。通过对MTB细菌溶液进行连续性10倍的稀释后,比较RT-LAMP和LAMP的灵敏度,并观察NTM和其他已知的呼吸道病原菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌)的检测结果,以确定引物特异性。用RT-LAMP、LAMP和罗氏培养法(Lowenstein-Jensen,L-J)检测131例结核病患者痰标本和24例阴性对照痰标本比较其临床检测效果。结果:通过灵敏度试验比较了RT-LAMP、LAMP方法的灵敏度,结果显示RT-LAMP方法比LAMP法高约10倍。RT-LAMP可检测出单个MTB菌。特异性试验利用RT-LAMP方法对已知的1株MTB、8株NTM和3株常见呼吸道细菌检测,结果发现只有MTB阳性。临床检测结果显示,RT-LAMP、LAMP和L-J法检测临床痰标本中MTB阳性检测率分别为97.7%(128/131)、78.6%(103/131)、73.2%(96/131),阴性对照只有L-J法有1例假阳性。RT-LAMP方法的阳性检测率高于LAMP和L-J法(P<0.01,P<0.01)。18例痰菌阳性的肺结核患者,在抗结核治疗前应用RT-LAMP和LAMP检测痰液标本,两种方法均具有较高的阳性检测率,但随着治疗时间的延长,RT-LAMP阳性检测率很快下降,而LAMP阳性检测率下降缓慢,说明RT-LAMP可以用来检测活菌。结论:1.本研究首次利用16S rRNA在MTB内呈多拷贝且仅存在于活菌的特点,创建了针对16S rRNA的RT-LAMP技术,用于检测MTB活菌。不仅证明了其灵敏度高、特异性强,而且操作简便、耗时短,适合基层及低资源医院。该技术有望发展成为快速检测MTB的有效手段。2.利用RT-LAMP技术,针对MTB 16S rRNA设计特异性引物,用于检测痰中MTB。通过与LAMP技术及L-J法比较,证明了其具有较高的灵敏度和特异性。第二部分应用逆转录-环介导等温扩增技术检测脑脊液中结核分枝杆菌16S rRNA目的:利用前期建立的RT-LAMP技术检测脑脊液中MTB,为结核性脑膜炎(Tuberculous meningitis,TBM)提供快速诊断的新方法。方法:选取105例患者脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)标本,其中确诊TBM有52例,疑似TBM有33例,阴性对照有20例。利用前期建立的MTB 16S rRNA RT-LAMP方法,比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度与特异性,在临床样本检测中,以FQ-PCR为对照,比较两种方法检测效果。结果:灵敏度试验结果显示RT-LAMP比RT-PCR的灵敏度高,RT-LAMP与RT-PCR最低检测值分别为1CFU/mL和10~2 CFU/mL。在常见的5种中枢神经系统病原体脑脊液标本中,利用两种方法均未扩增出特异性条带。RT-LAMP对TBM组、疑似TBM组阳性检出率分别为96.1%(50/52)、72.3%(24/33),RT-PCR对TBM组、疑似TBM组的阳性检出率分别为71.1%(37/52)、33.3%(11/33),FQ-PCR对TBM组、疑似TBM组阳性检出率分别为65.3%(34/52)、24.2%(8/33),三种方法对照组均无非特异性扩增。RT-LAMP阳性检出率高于FQ-PCR,两种检测方法差异有统计学意义(P<0.01);虽然在TBM组、疑似TBM组中,RT-PCR的阳性检出率略高于FQ-PCR,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过RT-LAMP检测技术检测脑脊液中MTB,与RT-PCR方法比较,也证明了其具有灵敏度高和特异性强的特点。