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杨生褐盘二孢菌(Marssonina brunnea)在杨属的不同寄主上存在两个专化型,从形态特征和现有的一些核酸分子序列标记上不易区分。研究病原菌在侵染寄主过程中对寄主的作用机理,分析两专化型菌株的差异性,同时对杨树叶片上的内生真菌种类进行调查,分析其与杨树黑斑病的关系。应用新的技术手段对病原菌的鉴定以及其与寄主的互作关系研究提供了新方向。本研究采集病原菌材料样本及健康叶片材料,组织分离得到病原菌和内生菌菌株,总DNA为模板进行PCR扩增ITS序列。联合盘二孢属核糖体转录间隔区(ITS)序列构建的系统发育树和ITS2的二级结构,来区分这两个专化型。采用离体叶片接种病原菌孢子,筛选出致病性强的专化型菌株。再将筛选出的菌株接种到黑杨盆栽苗叶片上,利用荧光显微镜观察菌株孢子侵染叶片的过程,选出孢子侵染叶片的时间节点,应用Real-time PCR检测分析在这几个时间节点寄主的相关基因表达情况。结果表明:(1)分离得到的内生真菌主要包括37个属,257株菌株,其中优势菌群为链格孢属(Alternaria)、假尾孢菌属(Pseudocercospora)、葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、暗球腔菌属(Phaeosphaeria)。同时筛选出两株菌株对病原菌生长有抑制作用。(2)在寄主叶片上挑取的病原菌孢子形态比较典型,而在培养基上培养的孢子形态差异较大,我们不能依据传统的芽管萌发数有效区分两个专化型。三种构建的ITS序列系统发育树的方法只能说明盘二孢属3个种的种间关系,却无法将参考ITS序列准确定位到专化型中。在ITS2二级结构预测模型中,通过比较盘二孢属ITS2二级结构发现:M.rosae和M.coronariae种内的菌株以及包括参考ITS序列在内的M.brunnea同一专化型的ITS2二级结构模型完全相同,但在这三个种之间及M.brunnea两专化型之间,ITS2二级结构上有多个位点的碱基差异,且种内专化型存在CBCs配对碱基差异。因此,应用ITS2二级结构和系统发育树可以更有效地作为杨生褐盘二孢菌两个专化型区分的分子依据。(3)杨生褐盘二孢两专化型菌株的孢子在接种后的三个时间点2h、24h、96h分别对应孢子的刚刚萌发,长出附着孢,产生鲜菌丝。荧光定量PCR结果表明:目的基因PR5在这三个节点上均上调表达;PR10在两个样本中均表现为接种后2h表达量迅速增高,而后降低;NPR1在H样本中先少量上调表达,24h下调表达,96h又上调表达到2h表达水平,与之相比较B样品在接种后上调表达量逐渐升高;Ptr WRKY89和Ptr LAR3均上调表达。有3个寄主的基因在两专化型的侵染过程中表达存在差异。