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葡萄育种中,无核是其重要的选育目标之一。随着人们生活水平的不断提高,无核葡萄在鲜食和制干上显示出越来越重要的作用。在国际市场中,销售量最大、最受人们欢迎的鲜食和制干品种主要是无核品种。但目前无核葡萄品种少,现有的品种大多果粒小、结实率低、无香味或香味不浓,培育经济性状优良的无核品种是葡萄育种的重要方向之一。
无核葡萄育种开始于美国,主要通过传统杂交育种方式。现育出的无核品种中绝大多数(70％多)是以有核品种为母本,无核品种作父本进行人工杂交育成。毋庸置疑,杂交育种无论是过去、现在和将来都是无核葡萄品种育种重要的方法。近年来,随着生物技术的发展,胚和胚珠培养技术、三倍体育种技术、生长调节物质在葡萄育种和生产上应用以及基因转导等技术为培育无核品种提供了新方法和新思路。
本研究主要根据无核葡萄形成的机理,利用生长调节剂花前处理无核葡萄品种形成种子；二倍体与四倍体杂交培育三倍体；利用四倍体自交产生三倍体；实生条件下二倍体雄性不育种质获得；以及葡萄遗传转化体系建立和转雄性不育Barnase基因种质获得等方面研究葡萄无核品种选育的可能途径。取得主要研究结果如下：
1.利用植物生长调节剂促使假单性结实的无核葡萄产生具有生活力的种子,采用或不采用胚培养产生实生苗,为无核葡萄育种提供一条便捷途径。采用不同生长素类和细胞分裂素类生长调节剂对‘火星无核’葡萄花前2w进行不同浓度的处理,对果实的有核率、种子形成大小、单果种子数目及种子成苗等方面进行了研究。BA、CPPU、KT、IAA、IBA、NAA不同浓度的处理都能使‘火星无核’葡萄产生残核。BA 5mg/L、10 mg/L,IAA 10 mg/L、20 mg/L,IBA 20 mg/L的处理有核率达100％；KT 5 mg/L处理种子大小指数96.6％,为最大,而CPPU 10 mg/L处理种子大小指数74.5％,为最小；BA 5 mg/L处理单果的平均种子数3.1粒,CPPU 10 mg/L处理单果的平均种子数0.5粒。KT 5 mg/L和10 mg/L处理诱导产生的种子离体培养得到萌发苗。不同浓度KT和BA处理‘火星无核’葡萄幼果内源IAA、iPAs及IAA/iPAs在花后1w明显高于对照。结果表明,生长素类和细胞分裂素类生长调节剂可以促进无核葡萄形成具有生活力的种子,可为无核葡萄育种提供了一种新的简便方法。
2.以二倍体葡萄品种和四倍体葡萄品种为亲本进行正反交,采用胚珠培养和田间自然播种杂交种子的方法,以期获得三倍体杂种单株。不同品种组合杂交坐果率不同,魏可(2x)×翠峰(4x)组合坐果率达41.03％,红高(2x)×巨峰(4x)的组合杂交坐果率为0％,不同组合间差异显著；取花后70d的胚珠接种于MS基本培养附加不同激素的培养基中,亚历山大(2x)×翠峰(4x)组合获得5株实生苗。自然播种杂交种子215粒,其中杂交组合‘魏可’ב翠峰’、‘巨峰’ב红高’、‘魏可’ב巨峰’的种子发芽成苗,成苗率分别为33.33％、20.00％、1.85％。
3.取四倍体品种‘翠峰’自交种子进行播种,通过流式细胞仪检测实生后代的单株染色体倍性,发现单株2004-5-11为三倍体植株；该单株花粉粒通过电子显微镜扫描显示花粉粒大多呈三角型,与‘夏黑’(3x)花粉粒形态相近；叶片气孔大小为0.04×0.022mm(L×B);花前套袋自交果粒为2.71g,无核,花期12.5 mg/L GA3处理一次,花后10d 25 mg/LGA3+5mg/L CPPU再处理一次,果实为15.61g,无核率100％,可溶性固型物(TSS)为16.7 Brix°,该单株为一优异的三倍体种质。
4.从‘魏可’(Wink)葡萄自交实生群体中发现一株雄蕊反卷的单株(2004-6-12),经花粉生活力测定、花粉粒电镜扫描和电镜透射观察,结果表明：该单株花粉粒在人工培养基上发芽率为0％,电镜扫描花粉粒为圆球形、小型、无发芽孔和发芽沟,外壁纹饰为网状,花粉粒横切面边缘光滑,确定为雄性不育单株(雌能花);该单株经花期GA3 25 mg/L和花后10d GA3 25 mg/L+CPPU 5 mg/L处理,单果10.2g,果实无核率100％,可溶性固形物(TSS)23 Bdx°,果实紫红色,品质优良。
5.以‘美人指’葡萄带腋芽的幼嫩茎段为外植体,研究了外植体的采集时间、节位、和消毒方法因素对‘美人指’葡萄无菌苗体系建立的影响。结果表明,晴天采集2～4节位的茎段,采用70％酒精10s+0.1％升汞6min+含0.05％吐温的2％次氯酸钠6min方法消毒,外植体成活率达80％以上,萌芽率达90％。成功的建立‘美人指’葡萄无菌体系。
对6-BA、TDZ与IBA不同浓度组合对‘美人指’葡萄叶片、叶柄和茎段不定芽离体诱导再生植株的效果进行了研究。结果表明：以茎段为外植体在MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.01 mg/L培养基上分化效果最好,再生率75.00％：叶片、叶柄分别在MS+6-BA 3.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L培养基上分化效果较好,再生率分别为63.16％和40.00％:TDZ和IBA的几种组合都能诱导不定芽再生,但再生率不高。
6.以‘美人指’葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究。结果表明：农杆菌侵染4min,共培养3d,卡那霉素选择压2.5mg/L,头孢霉素浓度250mg/L为最佳的农杆菌介导法‘美人指’葡萄遗传转化体系。
7.采用优化的农杆菌介导转化体系,对‘美人指’进行转化,共获得了13株抗性苗,农杆菌侵染后的抗性阳性率为1.92％。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中2株抗性苗GUS染色呈阳性,且1株PCR检测呈阳性,初步证实Barnase基因已经整合进入‘美人指’葡萄基因组中。 8.以‘魏可’葡萄花序为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,利用花粉管通道法对魏可进行转化,共获得了50株后代单株。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,13株GUS染色呈阳性,GUS阳性率为26％,其中5株都通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入魏可基因组中。