卵巢癌是女性常见生殖系统肿瘤,病死率居妇科恶性肿瘤首位。超过80%的卵巢癌为上皮性来源（Epithelial Ovarian Cancer, EOC）,其侵袭性高,对化疗反应差,常导致患者不良预后。近30年来,虽然手术技巧不断提高,新的有效化疗药物也不断更新,但上皮性卵巢癌的5年生存率也只有从36%提高到44%。因此研究卵巢癌特别是上皮性卵巢癌的发生、发展机制,从分子水平上寻找合理有效的治疗靶点,是提高卵巢癌生存率、延长生存期的关键。蛋白质的精氨酸甲基化广泛存在于生物体内,发挥许多重要的作用,如参与转录后调节、RNA加工、细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤形成等,而催化此反应的酶称做蛋白质精氨酸甲基转移酶（Protein Arginine Methyltransferase, PRMTs）。在人类中,到目前为止已经鉴定出11种该家族的成员（PRMT1-11）,除了PRMT2, PRMT10和PRMT11,该家族的其他成员均具有酶和催化精氨酸甲基化的活性。根据其催化精氨酸甲基化方式的不同,PRMTs家族主要分为2型,I型：包括PRMT1、PRMT3、PRMT4、PRMT6和PRMT8,催化形成单甲基（MMA）和不对称双甲基（aDMA）; Ⅱ型：催化形成单甲基（MMA）和对称双甲基（sDMA）,包括PRMT5、PRMT7和PRMT9。精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）是Ⅱ型中最早鉴定出的成员,位于人类染色体14q11.2,有2个亚型,分别长620个和637个氨基酸。PRMT5（?）具有重要的生物学作用,包括核糖体的生物合成,高尔基体的组装,生殖细胞特化,细胞分化,增殖和凋亡等。另外（?）PRMT5也能与其他基因相互作用,如周期蛋白cyclin E1、肿瘤抑制基因ST7和NM23、P53、程序性细胞死亡蛋白PDCD4、转录因子E2F-1和E-cadherin（?）等,参与了多种细胞内的生物过程,调控细胞的生长增殖,凋亡及侵袭转移过程。在人类的多种疾病中存在PRMT5的异常表达,特别是在一些肿瘤中,包括白血病和淋巴瘤,胃癌,乳腺癌、结直肠癌和肺癌等,而且研究也发现PRMT5与乳腺癌和结直肠癌患者的预后密切相关。总之越来越多的研究表明PRMT5参与了人类癌症的发生。然而,关于PRMT5在卵巢肿瘤发生发展过程中的作用还未知,因此本研究拟对PRMT5在卵巢癌中的作用进行探讨研究。第一部分：PRMT5在卵巢癌组织中的表达及其意义研究目的：1、检测并分析PRMT5在正常卵巢上皮、卵巢上皮性良性、交界性及恶性肿瘤中的表达是否存在差异。2、分析PRMT5表达与卵巢癌不同临床病理特征如病理类型、组织分化、临床分期、淋巴结转移、术后病灶残留等之间的关系。3、分别检测卵巢癌同一手术标本中PRMT5和Ki-67的表达,分析两者之间是否有相关性,以评价PRMT5在卵巢癌细胞增殖中的作用。4、分析PRMT5（?）的表达与卵巢癌患者预后的关系。研究方法：1.收集2005.1-2008.12山东大学齐鲁医院妇科住院治疗的正常卵巢组织12例、卵巢上皮性良性肿瘤20例,交界性肿瘤14例及卵巢癌118例的手术标本,并收集患者的完整临床及术后随访资料,本研究获山东大学齐鲁医院伦理委员会批准并得患者知情同意。2.应用免疫组化SP法检测不同标本组织中的PRMT5和Ki-67的表达。3.应用SPSS13.0软件对数据进行分析,卡方检验或者Fisher’s精确检验分析PRMT5在不同卵巢组织、不同临床病理指标中的表达差异；Spearman检验法分析PRMT5和Ki-67表达相关性：单因素和多因素Cox回归分析卵巢癌患者的预后影响因素；Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,Log-rank检验比较患者的生存率差别。结果：1. PRMT5的阳性表达主要位于细胞核和细胞浆中,在卵巢癌中的高表达率为83.1%（98/118）,显著高于正常卵巢组织的高表达率33．3%（4/12,P<0.05）及卵巢良性肿瘤中的高表达率30%（6/20,P<0.05）；与交界性肿瘤中的高表达率64.3%（9/14）相比,无统计学差异。2. PRMT5在卵巢癌浆液性病理类型、临床晚期（Ⅲ/Ⅳ）、低分化（G3）、有淋巴结转移和术后有病灶残留的组织切片中高表达（P均<0.05）。3.在Ki-67高表达的55例中,有54例高表达PRMT5（98.2%）,在Ki-67低表达的63例中,有44例高表达PRMT5（69.2%）, PRMT5在两组中的比较具有显著统计学差异。PRMT5与Ki-67的表达呈显著正相关性（r=0.377,P<0.001）。4.118例卵巢癌患者截止到随访结束,中位总生存时间为40.0个月,95%CI：19.1-60.1个月,中位无进展生存时间为20.0个月,95%CI：16.8-23.2个月。Kaplan-Meier （?）生存曲线显示PRMT5高表达组与低表达相比,其总生存率（Overall Survival, OS）和无进展生存率（Progression-free Survival, PFS）均明显降低（Log-rank检验,P均<0.001）。单因素Cox生存分析结果显示：在OS分析中,卵巢癌的浆液性病理类型、年龄≥60岁、临床分期Ⅲ/Ⅳ、肿瘤低分化（G3）和PRMT5的高表达等因素对患者的OS是不利因素（P均<0.05）。而在PFS中,除了淋巴结转移外其余的临床病理特征及Ki.67高表达均为患者PFS的不利因素（P均<0.05）。5.Cox多因素回归分析中,PRMT5高表达、年龄≥60岁,临床Ⅲ/Ⅳ期对OS是独立的不良预后指标（P均<0.05）；而PRMT5高表达、残留病灶存在、临床Ⅲ/Ⅳ期为PFS独立的不良预后因素,能显著降低患者的PFS（P均<0.05）。结论：1. PRMT5在上皮性卵巢良性、交界性及恶性肿瘤中的表达逐渐升高,且PRMT5的高表达与卵巢癌的不良临床病理特征相关,说明PRMT5参与了卵巢肿瘤的发生发展过程。2. PRMT5与Ki-67的表达呈显著正相关,说明PRMT5可能参与了卵巢癌细胞的生长和增殖过程。3.单因素和多因素的生存分析结果显示PRMT5对于卵巢癌的预后是一个独立的因素,高表达PRMT5能显著降低患者的OS和PFS。第二部分：靶向沉默PRMT5的表达对卵巢癌细胞系生物学行为的影响及机制研究研究目的：通过转染靶向PRMT5的siRNA来抑制卵巢癌细胞系A2780和SKOV3I中PRMT5f的表达,观察靶向降调其表达对卵巢癌细胞系生物学行为如生长增殖、凋亡和侵袭转移等能力的影响,探讨PRMT5在卵巢癌分子发病中的作用机制,为卵巢癌的基因治疗提供理论依据。研究方法：1.设计并体外化学合成靶向PRMT5（?）的2条siRNA序列（siP1和siP2）及阴性对照siRNA序列（siC）,并在脂质体LipofectamineTM2000（?）的介异下转染进入卵巢癌细胞系A2780和SKOV3。2.应用Real-time PCR和Western blot技术分别检测卵巢癌细胞系转染48小时后的PRMT5mRNA和转染72小时后的PRMT5蛋白的变化,筛选出具有最佳干扰效果的siRN八序列,作为后续研究的序列。3.应用CCK8、BrdU（?）参入和Ki-67标记实验分别检测转染PRMT5-siRNA后的卵巢癌细胞系的生长和增殖能力的变化。4. Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测转染PRMT5-siRNA后卵巢癌细胞系凋亡的变化。5.应用Transwell小室技术,检测转染PRMT5-siRNA后卵巢癌细胞系迁移和侵袭能力的变化。6. Western blot技术检测PRMT5表达抑制后E2F-1、cIF4E和E-cadherin蛋白的变化。7. SPSS13.0统计软件对数据进行分析。计量资料用平均值±标准差表示,组间差异应用独立样本的t检验分析。结果：1.靶向PRMT5的两条siRNA序列和阴性对照序列均成功转染卵巢癌细胞A2780和SKOV3,转染效率90%以上。2. Real-time PCR和Western blot实验结果均显示：siP1（?）序列能够显著减少A2780和SKOV3中PRMT5的mRNA和蛋白的表达；而siP2（?）序列只能减少SKOV3细胞中的PRMT5的表达,而对A2780的作用微弱。综合实验结果,siP1序列能够显著抑制A2780和SKOV3细胞中PRMT5的表达,筛选作为后续实验的干扰序列。3.在CCK8实验中,转染后72小时始,siP1组与siC组和正常未转染组（Normal）相比,细胞生存率开始明显降低,且随着时间延长,生存率降低更明显,两种细胞系的结果类似。观察至120小时,A2780-siP1组生存率约24.4±0.9%,SKOV3-siP1组生存率约36.9±1.7%,均明显低于siC组（P均<0.001）。4.A2780细胞中,siP1组的BrdU阳性率明显低于siC组（11.7±1.5%vs.33.3±1.5%,P<0.001）：SKOV3细胞中,siP1组的BrdU阳性率亦明显低于siC组（18.0±2.0%vs.35.3±1.5%,P<0.001）。5.在A2780细胞中,siP1组与siC组相比,Ki.67的标记指数（LI）明显下降（12.4±3₃%vs.50.2±8.0%,P<0.001）；在SKOV3细胞中,在siPl组和siC组中的LI分别为2.3±1.0%和23.6±6.6%,siP1组有明显降低（P<0.001）。6.A2780细胞中,siP1组明显高于siC组的凋亡率（29.4±0.9%vs.16.3±0.8%,P<0.001）：SKOV3中,siP1组亦明显高于siC组的凋亡率（28.9±0.6%vs.14.1±1.4%,P<0.001）。7. Transwell体外迁移和侵袭实验均表明：在A2780和SKOV3细胞中,siP1组的穿膜细胞数均明显少于siC组和Normal组,差异有统计学意义（P分别<0.001）。8.在转染后72小时,Western blot实验显示：A2780和SKOV3细胞中的E2F-1蛋白和E-cadherin蛋白表达明显上调。结论：1. PRMT5参与了卵巢癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的过程,干扰其表达能够显著减慢细胞的增殖,促进细胞的凋亡和减弱其迁移和侵袭的能力。说明PRMT5在卵巢癌的发生发展中有着重要的作用,同时也说明PRMT5有可能成为卵巢癌基因治疗的候选基因。2.PRMT5通过调控E2F-1的表达参与卵巢癌细胞增殖凋亡过程,调控E-cadherin（?）内表达参与卵巢癌细胞的迁移和侵袭过程。