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背景慢性乙型肝炎(CHB)是由乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染引起的可能危及生命的肝脏疾病,是影响全球大约2.5亿人的一个主要全球健康问题。目前各指南推荐抗病毒治疗药物有两类,注射用干扰素(IFN-α)和核苷(酸)类似物(NAs)。IFN-α存在较多的副作用,同时必须经由注射给药。NAs的效应靶位在HBV聚合酶,抑制病毒复制的作用明显,服用方便且安全。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清转换是慢性乙型肝炎(CHB)的功能性治愈的标志。但是由于NAs不能清除肝内的cccDNA,实现HBsAg血清学转换需要数十年,所以需要长期治疗。对于许多患者来说,考虑终生服药的经济负担、副作用和对育龄妇女的安全性问题,无限的长期治疗并不是一个理想的选择。最近的研究表明,如果能提供适当的停药监测并在需要时及时重新开始治疗,长期核苷(酸)药物治疗的CHB患者可以考虑停药。在最新的关于停药的meta分析综述中NA停药后36个月的病毒学复发率高达为38.2%,因此如何来预测停药后持久应答,更好的的来指导停药及关于停药后持久应答的机制现在还不清楚。HBV感染的自然史和疾病转归是多样的,主要取决于病毒和宿主的免疫应答之间的相互作用。CXCL13是趋化因子超家族CXC亚型的成员,通过其同源受体C-X-C趋化因子受体5(CXCR5)的作用,CXCL13对于成熟B细胞和T滤泡辅助细胞(Tfh)细胞是趋化性的。重要的是,CXCL13促进B细胞和Tfh细胞共同迁移到B细胞滤泡和生发中心(GCs),其中产生高亲和力抗体分泌记忆B和浆细胞。我们之前的研究发现,在替比夫定治疗期间,Kuffer细胞(KC)和血清CXCL13水平的增加与慢性HBV感染的免疫控制有关。最近的研究中,CXCR5+CD8+T淋巴细胞被定义为在慢性病毒感染中起到抗病毒效应的一个新的细胞亚群。在HIV感染中,CXCR5+CD8+T淋巴细胞的频率与病毒载量呈负相关,并且具有较强的抗病毒能力。然而,CXCL13及其受体CXCR5的表达与长期核苷(酸)类药物治疗停药后持久应答之间的关联尚不清楚。目的通过对本课题组前瞻性停药队列中患者停药后的血浆CXCL13水平及外周单个核细胞中(PBMC)中CXCR5+CD8+T淋巴细胞水平进行检测,观察其临床预后,从中探索可能与持久应答相关的免疫学指标。方法1.研究对象本研究的患者信息及标本均来自本课题组的一项前瞻性、开放性队列研究。在符合入组和排除标准后进行停药观察和规律随访。入组标准:HBeAg阳性的代偿期患者维持核苷(酸)类药物治疗,至HBVDNA低于检测线以下、ALT水平正常,HBeAg发生血清学转换后,至少再巩固治疗12个月维持完全应答;HBeAg阴性的代偿期患者维持核苷(酸)类药物治疗,至HBVDNA低于检测线以下,ALT水平正常,至少再巩固治疗18个月维持完全应答。临床复发,定义为随访中任意时间点出现 HBV DNA>2000IU/mL,伴ALT≥5ULN 或TBIL≥2ULN,需排除其它原因导致的肝功能异常;或ALT≥2ULN且<5ULN,TBIL<2ULN,并经过间隔至少2周的ALT检查证实ALT仍≥2ULN,期间不允许使用护肝药物,需排除其它原因导致的肝功能异常。HBsAg清除定义为HBsAg低于检测下线(0.05IU/ml)。2.外周血血浆细胞因子检测用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测受试者血浆细胞因子的表达水平。3.检测外周血中CXCR5+T细胞的频数复苏冻存的PBMC,采用流式细胞术检测长期核苷酸类药物治疗停药基线持续应答组(SR)和临床复发组(CR)外周血CXCR5+细胞,CXCR5+CD4+T细胞及CXCR5+CD8+T淋巴细胞频数及其记忆细胞子集的表达。4.CXCR5+CD8+T淋巴细胞参与停药后持久应答的免疫学机制用流式细胞术分析比较SR和CR外周血CXCR5+CD8+T淋巴细胞PD-1、Tim-3和CD69表达水平差异,同时分析比较停药患者外周血CXCR5+CD8+T淋巴细胞和CXCR5-CD8+T淋巴细胞PD-1、Tim-3和CD69表达水平和记忆细胞子集的差异。用佛波酯/伊诺霉素(PMA/ionomycin)刺激停药患者PBMC,ICS检测CXCR5-CD8+T和CXCR5+CD8+T淋巴细胞分泌细胞因子情况。结果:1.停药基线的血浆CXCL13水平能独立预测长期核苷酸类药物停药后临床复发在105例停药患者中,47例患者发生临床复发。COX风险比例回归模型多因素分析显示停药基线血浆CXCL13水平(HR0.26,95%CI0.31-0.52,p<0.001)是临床复发的独立预测因子。2.停药基线的血浆CXCL13水平能独立预测长期核苷酸类药物停药后HBsAg清除在105例停药患者中,11例患者发生HBsAg消失。COX风险比例回归模型多因素分析显示停药基线血浆CXCL13水平(HR:3.01,95%CI 1.33-6.81,p=0.008)是发生HBsAg消失的独立预测因子。3.长期核苷酸药物治疗停药后持续应答组高表达CXCR5+CD8+T淋巴细胞持续应答组患者外周血CXCR5+CD8+T淋巴细胞的频数显著性高于临床复发组(P=0.012),而CXCR5+CD8+T细胞记忆细胞子集无明显差异。CXCR5+CD4+T细胞频数及其记忆细胞子集在两组中无明显差异。在持续应答组CXCR5+CD8+T 淋巴细胞高表达CD69和低表达Tim-3(P=0.038,P=0.005)。4.CXCR5+CD8+T淋巴细胞分泌细胞因子和细胞毒功能增强与CXCR5-CD8+T淋巴细胞相比,CXCR5+CD8+T淋巴细胞中的中枢记忆性细胞(CD45RA-CCR7+)和幼稚细胞(CD45RA+CCR7+)比例增高,高表达CD69和PD-1,低表达Tim-3,分泌细胞因子(IFN-γ和TNF-α)功能和细胞毒性增强(CD107a))。结论:1.停药基线血浆CXCL13水平能独立预测长期核苷酸类药物停药后临床复发和HBsAg清除;2.与临床复发组,停药后持续应答患者外周血CXCR5+CD8+T淋巴细胞频数显著上调,且CXCR5+CD8+T淋巴细胞亚群具有更强的分泌细胞因子和细胞毒功能的能力,在停药后持久应答中起重要作用。