【摘 要】
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共辄亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一系列具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、降低胆固醇等功效的含有顺式或反式共轭双键亚油酸的总称。亚油酸异构酶(Linoleic acid
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共辄亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一系列具有抗肿瘤、提高免疫力、降血脂、降低胆固醇等功效的含有顺式或反式共轭双键亚油酸的总称。亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase,LAI)是亚油酸(Linoleic acid,LA)生物转化为共辄亚油酸的一个重要酶。植物乳杆菌P-8也有LAI,但其结构和功能及其催化机制不甚清楚。本研究为了探究植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶的酶学性质和一些必需基团,构建了植物乳杆菌P-8LAI的原核表达重组菌BL21-pET28a-LAI。对目的基因IPTG诱导表达条件进行优化,结果表明重组LAI的最佳表达条件是:IPTG终浓度为.0.1mM,130r/min,14h摇床诱导培养。诱导表达的野生型重组LAI经镍柱子纯化后用气相色谱法进行酶学性质分析,结果表明该酶的最适底物浓度是0.3mg/mL,最适温度为37℃,最适酶液体积为100μL,最适 pH 值为 7.0。Km=211.368 g/L,Vmax=75.188 mg/L×h。利用 Specia lized BLAST、http://smart.embl-heidelberg.de/和 vecterNTI 对亚油酸异构酶进行结构分析,锁定可能的6个必需位点,用QuickChange法成功构建了六个点突变体的重组质粒 pET28a-T563C-LAI、pET28a-G320T-LAI、pET28a-A515C-LAI、pET28a-G203C-LAI、pET28a-A389T-LAI和 pET28a-G458T-LAI。诱导表达的6个重组突变LAI,经镍柱子纯化后,用气相色谱法分析其活力并与重组野生型LAI相比较,六个位点的改变均引起酶活力发生大的改变。因此,可以确定LAI的188位、107位、172位、68位、130位和153位的氨基酸残基全为必需基团。
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