研究背景近年来的研究表明,肾小球上皮细胞足突(Foot processes, FP)及相邻足突间的裂孔隔膜(Slit diaphragm, SD)是保持肾小球滤过膜生理屏障功能的最重要结构。上皮细胞特殊结构的维持主要依赖于以肌动蛋白为主的细胞骨架系统(actin细胞骨架)和足突中表达的特异性蛋白分子(足突分子)。自1998年以来,人们已经发现多个表达在肾小球上皮细胞足突及裂孔隔膜的分子,在维持肾小球发育、滤过膜完整性、足细胞信号分子传导、防止蛋白尿漏出等方面起着非常重要的作用。足细胞通过调整自身形态,改变细胞之间的滤过间隙从而适应肾小球滤过容积的改变,这一功能的完成依赖于足细胞强大的细胞骨架系统,而Ⅰ型肌球蛋白的功能与actin细胞骨架密切相关。已有研究发现,Myosin I类分子中的Myo 1 e,当其表达下调后,实验动物斑马鱼出现水肿(pericardial edema)、肾小球局部细胞数量减少及pronephric cyst、以及前肾小管和前肾导管管腔、上皮细胞胞体内吞体(类似于人类肾小球疾病时的蛋白尿)等改变。Myole基因敲除的小鼠出现了蛋白尿以及慢性肾损害,超微结构显示肾小球基底膜增厚,上皮细胞足突融合等改变,表明Myole对足细胞和肾小球滤过膜的功能完整性确实是必需的。但是目前并没有从细胞分子水平研究Myole敲低后对足细胞功能的影响及其相关机制机制。目的探讨Myole表达敲低后肾小球足细胞的形态、结构及功能的变化。阐明Myole蛋白在维持足突结构及肾小球滤过屏障中可能所起的作用,及其与细胞骨架F-actin之间的相互作用机制。方法1、细胞培养：将小鼠足细胞系MPC5细胞株进行贴壁培养,在33℃、γ-干扰素条件下增殖培养,37℃分化成熟。通过免疫荧光的方法用足细胞相关蛋白分子Nephrin, CD2AP鉴定足细胞。2、免疫荧光方法检测Myole及F-actin蛋白在足细胞不同状态下的分布及表达情况。3、根据Santa Cruz公司提供的试剂及实验方法对足细胞进行稳定转染敲低myole实验,并且设立control组及Scrambled negative control.4、用实时荧光定量方法从mRNA水平检测干扰效果,以β-actin作为内参,并且检测了Myole与β-actin扩增效率的一致性,相对定量方法分析表达差异。5、用Western-Blot方法从蛋白水平检测myole的干扰效果。以β-actin作为内参,经过Image j软件对灰度进行分析,半定量分析蛋白表达水平。6、免疫荧光的方法观察myole干扰后及足细胞形态学所发生的改变。7、免疫荧光的方法检测myole干扰后F-actin的结构变化。8、用MTT细胞增殖法检测不同处理组细胞增殖能力,共设6个时间点检测MTT的OD值,分别为24h、48h、72h、96h、120h、144h。9、不同处理组小鼠足细胞静默处理后,分别利用Transwell小室在无血清培养基中培养,评估细胞的迁移情况。10、不同处理组细胞经过50μg／ml的PAN(嘌呤霉素氨基核苷)处理后,继续培养48小时后,计数贴壁的细胞,统计分析。11、不同处理组细胞消化后以相同的密度重新接种于六孔板中,37℃孵育1小时后,倒掉培养基,进行细胞计数,对细胞黏附能力进行评估。12、不同处理组细胞用FITC-Transferrin于37℃条件下孵育5小时,PBS洗涤后观察细胞内吞FITC-Transferrin的阳性率,从而检测细胞的内吞能力。结果1、不同状态下的细胞形状及足细胞鉴定：增殖状态的细胞多呈梭形、多边形,细胞核圆形,位于细胞中央,足突较短较粗较少。分化成熟的足细胞细胞形状不规则,胞体大,胞浆丰富,核圆形,位于细胞中央。足突较长较细较多,有些足突末梢还会分出树突状的分叉。Nephrin及CD2AP作为鉴定足细胞的蛋白分子,可见足细胞内有明显特异的表达。2、在未分化的足细胞中,Myole主要集中分布在核周及细胞主要突起的近核部,F-actin在胞浆沿细胞长轴向细胞主突起分布,在非许可条件下分化2周后,足细胞内的Myole荧光点状散布于胞浆,且向周边聚集,次级突起荧光染色明显,F-actin在分化中足细胞内呈放射状分布,蛋白丝伸展到细胞周边新形成的足突内。3、实时荧光定量方法从mRNA水平检测干扰效果：实验表明目的基因Myole和内参基因β-actin的扩增效率近似相等,故可用相对定量分析法来分析目的基因的改变量,得出如下结果：乱序阴性对照组myole的表达量是对照组的0.857±0.154倍；干扰组myole的表达量是对照组的0.250±0.0892倍；乱序对照组与对照组之间无明显统计学差异(P>0.05),而干扰组与对照组及乱序对照组间均有明显的差异(P<0.01)。Western-Blot法半定量分析对照组myole/β-actin的比值1.638±0.061：乱序阴性对照组比值为1.547±0.050；干扰组为0.851±0.0421；通过单因素方差分析检验,阴性对照与对照组之间无明显差异,干扰组与对照组细胞之间有显著差异,P值<0.01。4、Myole基因干扰后足细胞形态的变化：干扰后的细胞可见细胞胞体缩小,边缘不整,细胞足突的融合,细胞增殖缓慢。5、细胞干扰后骨架蛋白F-actin的变化：对照组及乱序阴性对照组的足细胞具有大量平行排列的较细的弹力蛋白丝(F-actin),扩展横跨整个细胞。而干扰组细胞,大量的弹力蛋白丝消失,但可见非常亮的具刻点形状的肌动蛋白凝聚物。(×200)6、细胞功能的变化：①MTT检测细胞增殖实验,计算每组的MTT OD值,对照组与阴性对照组数据经过统计学配对t检验,p<0.01,两组间具有明显差异,对照组与干扰组数据经统计学配对t检验,p<0.01,故具有统计学意义。阴性对照与干扰组之间进行统计学配对t检验,p<0.01,两者间差异明显。并且计算Scrambled negative control组与干扰组的细胞抑制率,阴性对照细胞生长抑制率不明显,而干扰组细胞在每个时间点的抑制率明显。通过统计学分析,配对t检验,p<0.01,具有统计学意义。②足细胞体外Transwell迁移实验,在200倍显微镜下计数Transwell膜底面的迁移细胞(图15),对照组细胞数为84.67±10.94个,阴性对照组迁移细胞数为82.33±9.07,干扰组迁移细胞数为26.14±4.30个,经过单因素方差分析发现阴性对照组与对照组之间P>0.05,无统计学差异；而干扰组与对照组P<0.01,具有明显的统计学差异；干扰组与阴性对照组相比,P<0.01,亦具有明显统计学差异。③足细胞黏附实验：,37℃孵箱孵育1小时,计数贴壁细胞。结果显示干扰组细胞的黏附能力明显减弱,在200倍显微镜下计数六孔板上的贴壁细胞,对照组贴壁细胞数为对照组细胞数为132.17±19.64个,乱序阴性对照组贴壁细胞数为123.17±12.98；干扰组贴壁细胞数85.17±7.73个,乱序阴性对照组与对照组相比并无明显差异,P>0.05,而干扰组与对照组之比,P<0.01,两组间具有明显统计学差异。④足细胞分离实验,不同处理组的足细胞用高浓度的PAN作用48后,产生急性损伤,从培养瓶上脱落,将为脱落的细胞经过多聚甲醛固定后,用结晶紫染色计数细胞数,观察细胞形态,对照组贴壁细胞数为对照组细胞数为104.50±6.02个乱序阴性对照组贴壁细胞数为99.00±6.13；干扰组贴壁细胞数71.00±18.45个,乱序阴性对照组与对照组相比并无明显差异,P>0.05,而干扰组与对照组之比,P<0.01,两组间具有明显统计学差异。⑤足细胞内吞作用检测,免疫荧光结果显示干扰组细胞内吞作用明显减弱,们还计数了每组至少100多个细胞,计算出转铁蛋白阳性的细胞率,进行统计学分析,control组阳性率94.32±1.825%, Scrambled negative control组阳性率91.10±4.243%,干扰组细胞23.81±3.564%,干扰组与对照组间P<0.01,具有明显差异,乱序阴性对照和对照组间P>0.05。结论1、myosinle在不同时期的细胞中分布不同,故其可能参与了足突的形成过程。2、myosinle在维持细胞形态方面发挥重要的作用。3、myosinle可能通过影响F-actin的结构而使得细胞形态发生改变。4、Myole通过介导细胞的增殖能力,黏附能力,抗损伤能力及内吞作用使足细胞受到损伤。Myole是足细胞维持正常的细胞形态及发挥正常的细胞功能必不可缺少的组成成分。