彩绒革盖菌草酸脱羧酶的制备及应用

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草酸脱羧酶是一种含锰的酶,在白腐菌中广泛存在,少数低等真菌和细菌中也能产生。目前,至少十多种草酸脱羧酶得到了分离和纯化。该酶是一种氨基酸残基在379个左右的单体酶,一般都为酸性糖蛋白,含有2个锰离子,形成2个活性区域;表面一些氨基酸被不同程度地糖基化。晶体结构和其它一些波谱学研究解释了其空间结构和可能的电子传递机制。已研究的该酶基因中都含有17个左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。一些特殊氨基酸序列的存在决定了该酶的表达形式为诱导型,菌株的基因调控序列中含有一段受草酸化合物作用的序列。该酶的基因在一些酵母和植物等异源表达系统中有成功表达的报道。该酶的应用主要集中在以下几方面:造纸废水中的草酸盐降解;食品中的草酸降解;草酸生物检测(如临床诊断、食品中草酸检测)等。 本课题首先对产草酸脱羧酶的菌种作了筛选研究,所用菌种为彩绒革盖菌Trametes versicolor,黑曲霉Aspergillus niger,米曲霉Aspergillus oryzae。筛选的方法为无诱导培养和草酸诱导培养两种方法。通过筛选发现白腐菌T.versicolor是较好的产酶菌株。进一步的实验是对筛选所得菌株进行产酶研究。主要研究内容为该酶的诱导因素方面,具体包括诱导剂的种类、诱导剂的量以及添加的时间等一系列影响因素。所用的诱导剂为有机酸和无机酸(例如盐酸、硫酸、磷酸、草酸、乙酸、丙二酸、丁二酸、酒石酸、柠檬酸、反丁烯二酸等),控制其离子强度和培养液pH值来观察诱导产酶情况。通过测定菌体生长过程中的不同参数(例如酶活、蛋白含量、生物量等)来比较不同诱导条件下的产酶优劣,得出了诱导产酶最好的诱导剂是草酸,并且进一步对诱导剂草酸作了添加浓度方面的优化,发现20 mM草酸的诱导效果最好。本实验还研究了草酸脱羧酶用于测定一些蔬菜样品中的草酸浓度。通过草酸脱羧酶与样品中的草酸反应得到甲酸和二氧化碳,在甲酸脱氢酶和辅酶NAD+的作用下,运用紫外分光光度计检测NADH在340 nm处的吸光值,计算得到样品中草酸的含量,从而初步建立了一种简便、快捷、准确的草酸测定方法。
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