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背景/目的:非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是目前已知的患病率和死亡率最高的恶性肿瘤。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)吉非替尼作为EGFR敏感性突变阳性NSCLC患者的一线治疗方案,在临床上具有非常显著的疗效,但是获得性耐药的发生发展是目前吉非替尼临床应用中最主要的障碍,其产生机制目前尚未完全阐明。长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的RNA序列,一般认为不具有编码蛋白质的能力。但是,近年来的诸多研究表明,lncRNAs可以参与许多细胞内关键的生物学过程,这其中包括了基因转录、蛋白质功能以及组蛋白调控等。同时,研究人员发现,lncRNAs表达失调还可能与多种肿瘤的发生发展以及耐药过程有关。本研究主要观察了NSCLC细胞在吉非替尼获得性耐药产生前后lncRNAs的表达变化情况,并筛选出耐药相关的lncTRMU,观察了该分子对NSCLC细胞吉非替尼敏感性的影响并初步探索了其作用机制。方法:(1)用逐渐增加细胞培养基中吉非替尼浓度的方法诱导吉非替尼敏感性NSCLC细胞株对吉非替尼产生获得性耐药。(2)分别用CCK-8法检测敏感株及耐药株中加入吉非替尼后的生长增殖状况,用流式细胞术检测吉非替尼对敏感株及耐药株的凋亡和周期的影响,验证获得性耐药株构建是否成功。(3)分别使用一代测序和RT-qPCR验证耐药株中是否存在T790M突变、EMT以及c-MET扩增。(4)用高通量测序RNA-seq技术检测吉非替尼获得性耐药发生前后NSCLC细胞中mRNAs、lncRNAs、circRNAs差异表达,通过生物信息学分析寻找可能与NSCLC细胞吉非替尼获得性耐药相关的lncRNAs。(5)用qRT-PCR法验证通过高通量测序技术挑选出的差异表达lncRNAs,进一步筛选出耐药相关lncRNAs——lncTRMU和lncERC1。(6)分别收集对吉非替尼敏感及耐药的NSCLC患者外周血样本,提取血浆中的总RNA,用qRT-PCR法验证体外实验中筛选出的lncTRMU和lncERC1在患者耐药前后的表达变化。(7)通过生物信息学分析挑选出的lncTRMU在基因组中的位置、编码蛋白的能力及保守性分析。(8)通过核质分离实验检测lncTRMU在NSCLC细胞中的定位情况。(9)构建过表达lncTRMU基因的质粒,转染至吉非替尼耐药性NSCLC细胞株中。用qRT-PCR法检测转染效率。(10)分别用CCK-8法和流式细胞术检测过表达lncTRMU对耐药性NSCLC细胞吉非替尼敏感性的影响。(11)用Western blotting法检测耐药株过表达lncTRMU前后EGFR信号通路相关蛋白的表达变化。(12)用qRT-PCR法检测吉非替尼耐药前后NSCLC细胞中lncTRMU临近基因的表达是否有变化。(13)用RNA-Pull down及质谱分析检测NSCLC细胞中lncTRMU的结合蛋白,初步探索lncTRMU在吉非替尼获得性耐药发生发展中的作用机制。结果:(1)在敏感株培养过程中逐渐增加吉非替尼浓度能够成功诱导NSCLC细胞对吉非替尼产生获得性耐药。(2)对耐药株EGFR基因外显子20进行一代测序显示耐药株中不存在存在T790M突变,RT-qPCR验证耐药株中没有EMT以及c-MET扩增。(3)高通量测序RNA-seq技术分别在HCC827细胞株和PC9细胞株中检测出906和838个差异表达的lncRNAs,其中在两对细胞株中共同变化的lncRNAs有39个,包含22个共同上调、17个共同下调的lncRNAs。(4)从共同表达变化的39个lncRNAs中挑选出6个加以验证,选出耐药后表达水平降低最为明显的lncTRMU作为研究对象。(5)血液样本分析显示lncTRMU在吉非替尼获得性耐药患者体内呈低表达,与细胞株结果一致。(6)生物信息学分析显示lncTRMU位于第22号染色体上,不具有编码蛋白的能力,基因保守性较强。(7)核质分离提取RNA后分析显示lncTRMU在胞核与胞质中皆有表达,但细胞核中表达较多。(8)在耐药株中过表达lncTRMU后,耐药株对吉非替尼的敏感性增强,EGFR蛋白通路激活受到抑制,证实lncTRMU与NSCLC吉非替尼耐药密切相关。(9)qRT-PCR分析证实lncTRMU临近基因的表达没有明显变化,由此推测lncTRMU并非通过顺势作用调节临近基因的表达发挥作用。(10)RNA-Pull down及质谱分析共检测出NSCLC细胞中有45个与lncTRMU结合的蛋白,为下一步该分子作用机制的探索打下了坚实的基础。结论:LncTRMU在NSCLC细胞吉非替尼获得性耐药的发生发展中扮演了重要角色,不仅可以作为临床NSCLC患者吉非替尼获得性耐药发生发展的生物标记物,还可以作为逆转吉非替尼获得性耐药的新的潜在干预靶点。