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第一部分：TaqMan荧光定量PCR方法研究NHEJ修复基因在人脑胶质瘤中的mRNA表达目的采用TaqMan荧光定量PCR技术，研究DNA双链断裂非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHET)修复通路5条基因LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6及XRCC7在人脑胶质瘤组织标本中的mRNA表达情况，为揭示DNA双链断裂NHEJ修复基因在胶质瘤发生发展中的作用提供依据。方法术中收集50例胶质瘤组织标本(星形细胞肿瘤30例，少枝胶质细胞瘤10例，室管膜瘤10例)和10例脑外伤正常脑组织标本。提取组织标本总RNA，并反转录为cDNA。所有基因的mRNA引物参照Gene Bank数据库设计，TaqMan探针由ABI公司的Primer Express v2.0软件包设计并合成。ABI7900全自动荧光定量PCR仪实时定量检测候选基因mRNA表达水平。SPSS13.0统计分析处理数据。结果与正常脑组织比较，NHEJ修复基因LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6及XRCC7在脑胶质瘤组织标本中的mRNA表达均明显降低，具有统计学意义(p＜0.05)。其中LIG4、XRCC4、XRCC5的mRNA表达与胶质瘤的恶性程度呈负相关，提示与胶质瘤的易感性相关；而XRCC6、XRCC7的mRNA表达与胶质瘤的恶性程度呈正相关，提示与胶质瘤的预后有密切关系。结论DNA双链断裂NHEJ修复通路基因LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6及XRCC7在胶质瘤中的mRNA表达明显下调，并且在胶质瘤发生发展的不同阶段具有不同的作用，表明DNA双链断裂NHEJ修复通路的修复功能障碍与胶质瘤的发生发展密切相关。第二部分：组织芯片(Tissue Array)及Western blot方法研究NHEJ修复基因在人脑胶质瘤中的蛋白表达目的应用高通量组织微阵列／组织芯片(high-throughput tissue microarray／tissue chip)及Western blot方法，分析DNA双链断裂非同源末端连接(NHEJ)修复基因LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6、XRCC7相应编码的蛋白在人脑胶质瘤中的表达情况。方法收集2004年1月～2005年12月手术切除的胶质瘤病理石蜡块标本300例，其中星形细胞肿瘤214例(WHOⅠ39例，WHOⅡ58例，WHOⅢ57例，WHOⅣ60例)，少突胶质细胞瘤49例，室管膜瘤37例。HE染色片进行肿瘤定位，每一张标本的HE片定两个点，符合肿瘤和瘤旁的有168例，符合肿瘤和肿瘤副点的有132例。制成组织芯片，应用高通量免疫组化方法根据相应蛋白的表达阳性率和表达阳性程度，半定量分析NHEJ修复蛋白LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6、XRCC7在胶质瘤中的表达情况。同时，选取16例胶质瘤组织标本和8例脑外伤正常脑组织标本，应用Western blot方法进行相关蛋白的定量检测，验证NHEJ修复蛋白在胶质瘤中的表达情况。结果DNA双链断裂NHEJ修复蛋白LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6、XRCC7在胶质瘤标本肿瘤及瘤旁组织中的阳性表达率均有显著差异，在肿瘤中的阳性表达率明显低于瘤旁正常组织(P＜0.05)；并且阳性表达强度也有显著差异，在肿瘤中的阳性表达强度明显低于瘤旁组织(P＜0.05)。其中LIG4、XRCC4、XRCC6、XRCC7蛋白与星形细胞肿瘤有关，在星形细胞瘤的肿瘤与瘤旁组织中的阳性表达率也具有显著差异(P＜0.05)。在星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤三种病理类型的比较中，只有XRCC7的阳性表达率和阳性表达强度有显著差异(P＜0.05)。Western blot定量分析结果表明DNA双链断裂NHEJ修复蛋白LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6、XRCC7在胶质瘤标本中的表达明显低于正常对照组，证实了组织芯片的免疫组化结果。结论高通量组织芯片及Western blot结果在蛋白水平证实DNA双链断裂NHEJ修复基因LIG4、XRCC4、XRCC5、XRCC6、XRCC7编码蛋白在胶质瘤中的表达明显下调，与第一部分NHEJ修复基因的mRNA表达结果相一致，证实DNA双链断裂NHEJ修复基因及其相应编码蛋白的表达下调在胶质瘤的发病机制中具有重要作用。第三部分：DNA双链断裂NHEJ修复基因单核苷酸多态性与人脑胶质瘤遗传易感性关联的研究目的研究DNA双链断裂非同源末端连接(NHEJ)修复基因XRCC5、XRCC6、XRCC7基因多态性与胶质瘤遗传易感性的关系，找到重要的易感性SNP位点及其单倍型。方法选择771例胶质瘤患者和752例正常对照者抗凝血，抗凝血标本抽提DNA。ABIPrimer Express V2.0软件包(ABI PRISM)设计相应引物并合成TaqMan—MGB探针(ABI公司)，采用美国应用生物系统ABI7900荧光定量PCR仪对XRCC5、XRCC6、XRCC7的22个tSNP位点的检测，结果用ABI SDS V2.1软件包进行分析。结果1)单位点分析可见：XRCC5有3个tSNP位点(rs828704，P=0.005；rs3770502，P=0.042：rs9288516，P=0.003)以及XRCC6有1个tSNP位点(rS132771，P=0.044)与胶质瘤的遗传易感性有显著相关性。2)单倍体型分析可见：XRCC5有一个单倍体型“CAGTT”与胶质瘤的患病风险有显著相关性(OR 0.60，95％CI0.43～0.85)。3)应用多因素降维法(MDR)分析表明XRCC5、XRCC6、XRCC7基因—基因相互作用的关系与胶质瘤的患病风险也具有显著相关性(P=0.001)。结论DNA双链断裂NHEJ修复基因XRCC5、XRCC6、XRCC7具有与胶质瘤的遗传易感性显著相关的tSNP位点及其单倍体型，证实DNA双链断裂NHEJ修复基因多态性与胶质瘤的遗传易感性密切相关。