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目前,病毒性心肌炎严重危害人类健康,抗病毒性心肌炎药物的设计和筛选对治疗该病尤为重要。B3型柯萨奇病毒(CVB3)是引起人类病毒性心肌炎最主要的病原体,其基因组只有一个开放阅读框,编码形成4个病毒衣壳蛋白(VP1-VP4)和7个非结构蛋白(2A-2C、3A-3D)。其中3C蛋白是柯萨奇病毒的一种自身水解蛋白酶,主要负责对大多数前体蛋白进行剪切,形成成熟蛋白,同时它对病毒RNA的复制,蛋白引物的形成也至关重要,对病毒的繁殖扩增极其重要,被认为是抗病毒药物设计的一个重要靶点。本论文首先使用原核表达体系实现CVB3-3C蛋白酶体外重组表达,依次经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析,获得高纯度CVB3-3C蛋白。为了实现针对CVB3-3C蛋白的药物筛选,我们通过优化实验确定了CVB3-3C蛋白药物筛选所需的缓冲液的类型、盐离子浓度及pH,并对体系中蛋白酶浓度、底物浓度及CVB3-3C蛋白酶对DMSO耐受浓度进行了优化；同时,进一步对体系的稳定性、可靠性进行分析评价,建立起一套完整的CVB3-3C蛋白药物筛选体系。利用该体系对2000多种化合物进行了筛选,共得到12种抑制率超过80%的化合物。其中6种化合物抑制效果较好,分别为：MDCE-10aIC50为36.70 μmol/L, MDCE-10c IC50为33.25μmol/L, MDCE-10e IC50为21.07 μmol/L, MDCE-A008 IC50为60.60 μmol/L, MDCE-A022 IC50为23.55 μmol/L, MDCE-A043 IC50为105.70μmol/L。用筛选得到的化合物与CVB3-3C蛋白酶进行共晶实验和药物浸泡实验,获得CVB3-3C蛋白酶与抑制剂的复合物晶体。利用X-衍射技术对复合物晶体进行分析,获得了CVB3-3C蛋白酶与化合物MDCE-A008的复合物晶体,分辨率为2.4 A。本论文在分子水平上建立起以CVB3-3C为靶点的药物筛选体系,并应用该体系筛选有效抑制剂,作为抗CVB3药物的目标化合物。同时,利用蛋白质结晶技术获得CVB3-3C蛋白酶与抑制剂的复合物晶体,为复合物进行结构解析以及CVB3药物目标化合物的改良提供数据支持。