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目的:1初探青蒿烯对荷瘤小鼠的瘤体抑制作用。2探讨青蒿烯通过造成肝癌细胞内DNA损伤进而促进肝癌细胞凋亡的分子作用机制。方法:1体内动物实验1.1青蒿烯对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响:通过对免疫缺陷鼠NODSCID皮下分别接种肝癌细胞株Hep3B2.1-7、QGY7703建立肿瘤模型后,皮下注射不同剂量的青蒿烯进行处理,观察青蒿烯对荷瘤小鼠移植瘤的体积的影响。1.2青蒿烯对荷瘤小鼠肝脏、肾脏的影响:动物取材后,对荷瘤小鼠的肝脏、肾脏进行甲醛固定、脱水、包埋、HE染色,最后进行病理切片,观察青蒿烯在体内吸收后对肝脏、肾脏的影响。2体外细胞实验2.1青蒿烯对肝癌细胞的生长活力的影响:在肝癌细胞Hep3B2.1-7、QGY-7703、Huh7及sk-hep1中,通过MTT法检测青蒿烯对细胞生长的抑制作用的剂量依赖性实验,初步明确青蒿烯的有效作用浓度范围。2.2青蒿烯对正常细胞的生长活力影响:在正常细胞包括肝脏成纤维细胞(liver fiberblast)、正常肝细胞(L02)、人肾小管上皮细胞(HK2)、人支气管上皮样细胞(BEAS-2B)中,通过MTT法检测青蒿烯对正常细胞的细胞活力影响的实验,初步探明青蒿烯对肿瘤细胞的抑制作用非毒性作用。2.3青蒿烯对肝癌细胞凋亡及凋亡相关蛋白PARP、caspase3、caspase9的影响:在肝癌细胞Hep3B2.1-7、QGY-7703中,通过AnnexinV/PI流式细胞术检测青蒿烯促近细胞凋亡的作用的剂量依赖性的实验,初步确定青蒿烯有效的作用剂量范围;通过Western blot法进行青蒿烯对凋亡相关蛋白PARP、caspase3、caspase9的表达影响的剂量依赖性实验,进一步验证青蒿烯的促凋亡作用。2.4青蒿烯对肝癌细胞DNA损伤及γH2AX蛋白磷酸化的影响:在肝癌细胞Hep3B2.1-7、QGY-7703中,通过Western blot法进行青蒿烯对Y H2AX蛋白磷酸化影响的剂量依赖性实验,明确青蒿烯造成肝癌细胞DNA损伤的位点。2.5青蒿烯对肝癌细胞ATM磷酸化的影响:通过Western blot法进行青蒿烯对ATM磷酸化蛋白的剂量依赖性实验,明确青蒿烯活化ATM的浓度剂量范围。结果:1动物实验1..1青蒿烯对免疫缺陷鼠NODSCID肝癌细胞移植瘤的体积及瘤重的影响:青蒿烯可以抑制NODSCID小鼠Hep3B2.1-7和QGY-7703移植瘤体积及瘤重的增长,呈剂量依赖的关系。1.2青蒿烯对免疫缺陷鼠NODSCID脏器的影响:青蒿烯对NODSCID小鼠的肝脏、肾脏两大重要脏器无明显损伤。2细胞实验2.1青蒿烯对肝癌细胞株Hep3B2.1-7、QGY-7703、Huh7及sk-hep1的细胞活力的影响:青蒿烯可以抑制肝癌细胞株Hep3B2.1-7、QGY-7703、Huh7及sk-hep1的细胞生长活力,呈浓度剂量依赖关系。2.2青蒿烯对正常细胞包括肝脏成纤维细胞(liver fiberblast)、正常肝细胞(L02)、人肾小管上皮细胞(HK2)、人支气管上皮样细胞(BEAS-2B)的细胞活力的影响:青蒿烯对正常细胞株Liver fiberblas、L02、HK2、BEAS-2B无明显影响。2.3青蒿烯对肝癌细胞株Hep3B2.1-7、QGY-7703凋亡的影响及对凋亡蛋白PARP、caspase3、caspase9表达的影响:青蒿烯可以促进Hep3B2.1-7、QGY-7703细胞的凋亡,呈剂量依赖关系;青蒿烯增加了凋亡蛋白PARP、caspase3、caspase9的剪切,即 cleaved PARP、cleaved caspase3、cleaved caspase9 蛋白表达上调,呈剂量依赖关系。2.4青蒿烯对肝癌细胞DNA损伤及γ H2AX蛋白磷酸化的影响:青嵩烯造成肝癌细胞Hep3B2.1-7、QGY-7703DNA的损伤;青蒿烯可以增加γH2AX蛋白的磷酸化,呈剂量依赖关系。2.5青蒿烯对肝癌细胞株ATM磷酸化的影响:青蒿烯可以增加ATM的磷酸化,呈剂量依赖关系。结论:1通过建立肝癌皮下移植瘤模型,证实了青蒿烯通过体内的循环吸收可以达到抑制肿瘤的生长的作用。同时,具有中医药的优势——对脏器的毒副作用小,小鼠肝脏、肾脏的病理切片显示,青蒿烯对动物脏器无明显损伤。2青蒿烯抑制肝癌细胞株生长活力的体外实验结果表明,青蒿烯可以明显抑制肝癌细胞株的生长活力,但对正常细胞株无明显影响。青蒿烯能造成肝癌细胞株的DNA损伤,进而激活ATM,使ATM磷酸化,进而引起肝癌细胞的凋亡。DNA损伤是诱导肝癌细胞凋亡的主要因素,但是青蒿烯是如何引起肝癌细胞DNA损伤的作用机制需要进一步实验证实。3最后,本实验的体内外结果一致,可以认为青蒿烯能够造成肝癌细胞DNA的损伤。