临床上,由于肿瘤、创伤、炎症等多种原因导致大量的骨缺损患者出现,这些骨缺损难以自行愈合,常需要填充骨移植材料以促进修复。目前常用的骨移植材料有自体骨、同种异体骨、异种骨以及合成材料,它们各有优缺点,其中自体骨是最理想的骨移植材料,其骨传导性、骨诱导性以及骨生成性较其他支架材料好;但自体骨供骨量及形状有限,同时在自体骨取骨处可能会出现一些严重的并发症,如出血、感染等。虽然异种骨的来源广泛,但潜在的严重免疫排斥反应限制了其在临床的使用。同种异体骨是另一重要的骨移植材料,它多取自于捐献的人体骨组织,在发达国家应用较为广泛;在国内,由于社会观念和文化传统与国外存在巨大差异,捐献尸体这一合法来源远不如发达国家。这可能会成为严重限制同种异体骨在临床上的推广和应用的瓶颈之一,因此寻找一切可利用的同种异体骨材料是迫切需要解决的问题之一。组织工程骨的出现为临床修复骨缺损提供了一种全新的治疗方法。种子细胞、支架材料和可促进骨细胞增殖和诱导成骨的骨生长因子是骨组织工程的三要素,其中支架材料可分为天然材料和合成材料两大类。天然支架材料主要来源于同种异体骨和异种骨。近年来,国内全髋关节置换术广泛开展。就每年的手术量和股骨头的骨量而言,髋关节置换术中切取的股骨头是同种异体骨材料的潜在来源。然而,缺血性坏死(全髋关节置换术患者的重要病因)的股骨头是否具有与正常骨一样的骨诱导性和骨传导性,是其是否能够成为制备骨移植材料和组织工程骨支架原料的决定性因素。为研究该问题,本实验将置换下来的缺血性坏死股骨头制作成临床常用的两种生物支架材料:脱钙骨基质(decalcified bone matrix, DBM)和脱蛋白骨(deproteinized bone, DPB),并将人骨髓间充质干细胞(human bone mesenchymal stem cells,hBMSCs)种植于这两种材料上,以了解人缺血性坏死股骨头制作的DBM和DPB与hBMSCs的体外相容性以及这两种材料在体外对hBMSCs的成骨诱导能力,为其临床应用提供初步的实验依据。方法1.股骨头的采集:选取临床上因股骨头缺血性坏死行髋关节置换术的患者的股骨头。纳入标准:(1)Ficat III、IV期;(2)无感染、肝炎、结核、性病或肿瘤等疾病。2. DBM和DPB的制备及形态学观察:将缺血性坏死股骨头的纤维结缔组织剔除干净,去除外周的软骨层,将股骨头锯成3mm×3mm×5mm左右大小的骨粒并制作成DBM和DPB。用扫描电镜观察材料的形态并测量材料孔径。3. hBMSCs的分离、培养和鉴定:获取健康志愿者的骨髓,分离hBMSCs,进行原代、传代和诱导培养。倒置显微镜观察细胞生长情况。鉴定hBMSCs的表面抗原标志物CD44和CD105。4. hBMSCs与DBM和DPB复合后形态学观察:倒置显微镜和扫描电镜下观察细胞与材料复合后的生长情况。将复合后的材料制成切片, HE染色,光学显微镜下观察细胞在材料上的生长情况。5. hBMSCs增殖活性检测:取单层培养的第三代hBMSCs,接种于5块96孔培养板,每孔加入150ul,1×106cells/ml。与同体积的支架材料复合,在1、3、5、7、14d用四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法(MTT法)分析细胞的增殖活性。以单层培养的不含材料的第三代hBMSCs为对照组。6.碱性磷酸酶(alkaline phosphosphatase, ALP)浓度检测:取单层培养的第三代hBMSCs (1×106 cells/ml)接种于24孔板,与同等大小的支架材料复合,加入诱导培养基,分别于1、7、14、21d消化细胞,进行ALP浓度检测。以单层培养的不含材料的第三代hBMSCs为对照组。7.骨钙素(osteocalcin, OC)浓度检测:取单层培养的第三代hBMSCs,以1×106 cells/ml接种于24孔板,与同等大小的支架材料复合,加入诱导培养基,分别于1、7、14、21d提取细胞培养液,以酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测培养基中骨钙素的活性。以单层培养的不含材料的第三代hBMSCs为对照组。8.培养基钙离子(Ca2+)浓度检测:取单层培养的第三代hBMSCs以1×106 cells/ml接种于24孔板,与同等大小的支架材料复合,加入诱导培养基,分别于1、7、14、21d提取细胞培养液,用VITROS 250全自动生化检测仪测定样品的Ca2+含量。以单层培养的不含材料的第三代hBMSCs为对照组。结果1.材料的形态特征:DBM颜色淡黄,质地较软,DPB颜色洁白,质地硬,脆。扫描电镜下可见DBM孔隙表面较粗糙,孔隙大小为15.4μm-88.4μm,平均孔径为40.85±21.75μm。DPB孔隙表面光滑,孔径大小为127μm-530μm,平均孔径为285.14±124.43μm。2. hBMSCs的形态和鉴定:分离的原代hBMSCs呈圆形,24h后可见细胞贴壁,接种5d后可见少量梭形细胞贴壁生长。原代培养的hBMSCs约12d左右达80%融合,呈长梭形生长,核浆比例大,17d左右长满。传代细胞2-3d完全贴壁,约5-7 d可达80%融合,细胞呈同向性生长,旋涡状盘旋排列,细胞细长而有突起。hBMSCs的表面抗原CD44、CD105免疫组化染色阳性,细胞呈棕褐色。3. hBMSCs与DBM和DPB复合后形态学观察:倒置显微镜观察显示,培养后21d,在DBM的孔隙中可见大量的细胞和细胞外基质,在DPB的孔隙中可见少量的细胞和细胞外基质,。HE染色显示复合培养14d、21d后DBM孔隙的边缘可见有细胞和细胞外基质。21d扫描电镜下观察可见DBM的孔隙中含有大量的细胞和细胞外基质,DPB的孔隙中可见少量的细胞及细胞外基质。4.细胞的增殖活性:细胞在两种材料上均有增殖活性,随着时间的延长,细胞的数量越多,各实验组的细胞均在第3d左右倍增。在第3、5、7、14d, DBM组对hBMSCs的增殖活性的影响与DPB组、对照组相比有统计学意义(P <0.01), DPB组和对照组相比无统计学意义(P>0.05)。5. ALP浓度:DBM组和DPB组ALP活性均随着时间的推移而增高,DBM组在第7、14、21d保持较高值;对照组ALP活性在第7d增高,第14、21d出现下降。在第7、14、21d,DBM组与DPB组、对照组的差异均有统计学意义(P<0.05),DPB组和对照组的差异也有统计学意义(P<0.05)。6. OC浓度:复合培养后第7d,DBM组中的OC浓度明显增加,而DPB组和对照组无显著变化。从第7d至21d,DBM组的OC浓度随时间的推移而明显增加,DBP的OC的浓度也随时间而增加。在第7、14、21d,DBM与DPB、对照组的差异有统计学意义(P<0.01),DPB组和对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。7.培养基Ca2+浓度:各组Ca2+浓度随着时间的推移都逐渐下降,其中以DBM组下降明显,在各个时间点上,DBM组的Ca2+浓度均比DPB组和对照组低,DPB组在各个时间点上的Ca2+浓度也较对照组低。在第7、14、21d,DBM组与DPB组、对照组的差异有统计学意义(P<0.05),DPB组和对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.以人缺血性坏死股骨头为来源,用Maddox法制备的DBM孔隙粗糙,孔径大小不一,平均孔径大小为40.85±21.75μm;用改良Kiel法制备的DPB孔隙光滑,孔径大小不一,平均孔径大小为285.14±124.43μm。两种材料的孔径均小于正常骨组织制备的材料孔径。2.以人缺血性坏死股骨头为来源,用Maddox法制备的DBM在体外与hBMSCs有良好的细胞相容性,能促进hBMSCs的增殖;用改良Kiel法制备的DPB与hBMSCs细胞相容性显著低于DBM。3.以人缺血性坏死股骨头为来源,用Maddox法制备的DBM在体外能促进hBMSCs向成骨样细胞分化;用改良Kiel法制备的DPB促进hBMSCs向成骨样细胞分化的能力显著低于DBM。4.以人缺血性坏死股骨头为来源,用Maddox法制备的DBM结构稳定,具有良好的细胞相容性和成骨诱导活性,可以用作治疗骨缺损的骨移植材料和骨组织工程中的支架材料;用改良Kiel法制备的DPB结构不稳定,易碎裂,促进hBMSCs增殖和成骨诱导活性较差,不宜作为骨移植材料或骨组织工程中的支架材料。