【摘 要】
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猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的多种猪病,包括:断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）、猪皮炎肾炎综合症（PDNS）、猪呼吸道疾病综合症（PRDS）等。而猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。大量研究已经证实PCV2和PRRSV都是导致猪只免疫抑制的重要病原,PCV2和PRRSV感染常常导致猪群其它感染性疾病的免疫失败和发病率
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猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的多种猪病,包括:断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）、猪皮炎肾炎综合症（PDNS）、猪呼吸道疾病综合症（PRDS）等。而猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。大量研究已经证实PCV2和PRRSV都是导致猪只免疫抑制的重要病原,PCV2和PRRSV感染常常导致猪群其它感染性疾病的免疫失败和发病率上升,因此PCV2和PRRSV被认为是给生猪养殖业造成经济损失最大的两种病毒。免疫防控（即接种疫苗）是预防PCVAD和PRRS产生的最有效途径。由于疫苗投入生产要确保其安全性,所以目前只有PCV2灭活疫苗和基于PCV2 Cap蛋白的亚单位疫苗两种商业化疫苗,并没有投入生产使用的减毒活疫苗,且前两者的细胞免疫效果较差,常需要刺激性较大的免疫佐剂和多次免疫才能达到较好的免疫效果。虽然PRRSV灭活疫苗和减毒活疫苗均已商品化,但其临床应用效果也并非完美。因此,本研究利用反向遗传学操作和基因工程技术制备表达PRRSV GP3-5嵌合抗原表位的复制缺陷型PCV2病毒,制备的突变PCV2病毒将具有极高的安全性,并能在进入宿主细胞以后表达GP3-5嵌合抗原表位,因此具有作为针对PRRSV的亚单位疫苗的潜力。主要研究内容及结果如下:1.构建Cap反式互补转基因PK15细胞系:利用试剂盒提取无内毒素质粒p CMV-CAP-opt。p CMV-CAP-opt瞬时转染PK15细胞,提取细胞总RNA进行RT-PCR验证,表明其能表达Cap基因。p CMV-CAP-opt经过内切酶Afl II单酶切,然后胶回收p CMV-CAP-opt线性片段转染PK15细胞,利用G418反复加压筛选得到单克隆Cap反式互补转基因PK15（CTC-PK15）细胞,扩大培养得到Cap反式互补转基因PK15细胞系。IFA验证表明Cap反式互补转基因PK15细胞能表达Cap蛋白,CTC-PK15细胞构建成功。2.pOmni-PCV2-GP3-5感染性克隆构建:采用PCR重组克隆技术将人工合成的GP3I-GP5I-GP5IV嵌合抗原表位基因插入pOmni-PCV2质粒中,在PCV2的Cap基因中插入长180bp的GP3-5嵌合抗原表位序列,替换Cap的122-183位AA。该突变插入置换了去掉Cap中174bp序列,故突变病毒基因组增大6bp。经特异性PCR扩增GP3-5基因验证表明pOmni-PCV2-GP3-5感染性克隆构建成功,测序结果也显示pOmni-PCV2-GP3-5感染性克隆构建成功并无碱基突变。3.PCV2-GP3-5病毒拯救:将pOmni-PCV2-GP3-5感染性克隆用内切酶Sal I酶切胶回收PCV2-GP3-5基因组片段。T4 DNA连接酶环化后转染CTC-PK15细胞,细胞盲传3代后,收取第3代病毒分别感染CTC-PK15细胞和PK15细胞,细胞继续盲传3代后提取第6代病毒DNA进行PCV2基因和GP3-5基因的特异性PCR检测并拯救突变病毒。特异性PCR检测结果显示PCV2-GP3-5病毒拯救成功。4.PCV2-GP3-5病毒的复制缺陷验证:拯救成功的PCV2-GP3-5病毒转T75细胞进行增殖。收取病毒、提取病毒DNA后采用PCR模板无限稀释法测定PCV2-GP3-5病毒的TCID5约为10~3。用TCID50为10~3的PCV2-GP3-5病毒分别感染CTC-PK15细胞和PK-15细胞,48小时后收毒,再分别感染新的细胞,如此传3代,分别提取各代次病毒DNA,通过特异性PCR验证其在正常细胞的复制缺陷特性。结果显示PCV2-GP3-5病毒感染的各代CTC-PK15细胞内均能检测到病毒,而只在PCV2-GP3-5病毒感染的第一代PK15细胞中检测到病毒,证明PCV2-GP3-5病毒不能在正常PK15细胞中传代。5.PCV2-GP3-5病毒在PK-15细胞中的GP3-5表达验证:用PCV2-GP3-5病毒感染正常的PK15细胞,并以不感染任何病毒的正常PK15细胞作空白对照,36小时后提取细胞总RNA进行RT-PCR扩增。GP3-5嵌合抗原表位基因的RT-PCR结果显示GP3-5嵌合抗原表位基因基因能够在正常PK15细胞内表达,表明PCV2-GP3-5病毒可作为PRRSV的亚单位疫苗载体。综上所述,本研究制备的复制缺陷型PCV2-GP3-5活病毒不能在PK15内复制传代,因此具有更高的安全性,并具有作为针对PCV2和PRRSV的双价活疫苗的潜力。
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