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Hsp70（70-kDaheatshockprotein）是一种高度保守的分子伴侣蛋白,其广泛存在于所有生物中,并参与了大量重要的生理过程。Hsp70通过协助蛋白质的折叠、组装和降解来维持细胞的蛋白质稳态,并可以被诱导表达以协助蛋白抵抗外界不利环境,因此在蛋白质质量控制中发挥着极为重要的作用。在真核生物中,Hsp70蛋白分化出了不同的亚型,并由于其表达水平、组织丰度、亚细胞结构定位的不同,导致它们之间出现了明显的功能歧化现象。与真核生物相似,原核生物的Hsp70也存在多拷贝现象,然而相关研究大多集中于单拷贝的热激诱导型Hsp70,对于多拷贝Hsp70存在的功能和意义仍知之甚少。考虑到Hsp70在细胞生命过程中的重要性和普遍性,探究多拷贝的Hsp70在细胞中所承担的功能,阐明不同Hsp70功能歧化的分子机制,对于我们理解细菌蛋白质控过程有重要的意义。黏细菌是一类广泛分布于各种环境中的革兰氏阴性细菌,以其复杂的社会性行为和庞大的基因组而著称。黏细菌的模式菌株——黄色黏球菌（Myxococcus xanthus）DK1622拥有9.14Mb的基因组,其中包含了大量的重复基因,是研究多拷贝Hsp70的理想材料。本文以DK1622为研究对象,探究了其中多拷贝Hsp70的功能歧化现象及分子机制,取得了以下几个主要成果:一、对代表性原核基因组进行保守结构域分析,首次阐明了多拷贝Hsp70在原核生物中的存在情况。本文通过对5551个代表性原核基因组所编码的蛋白质进行了保守结构域分析,共鉴定到9292个Hsp70超家族成员,并根据所含保守结构域的不同将其分为不同亚型（PRK00290、cd10170和CbnR蛋白）。hsp70基因的拷贝数在基因组中从0到23个不等,约有99.1%的基因组中至少包含一个拷贝的hsp70。其中PRK00290蛋白的分布最为广泛,存在于98.6%的原核基因组中;而cd10170蛋白和CbnR蛋白则只存在于36.7%和4.4%基因组中。此外,有2295个基因组包含多拷贝的hsp70基因,占所有基因组的41.3%。其中38个完整测序的黏细菌均编码了多个Hsp70蛋白,且均包含三种不同的亚型。这些结果表明,多拷贝Hsp70在原核生物中广泛存在,且在黏细菌中尤为普遍。二、探究DK1622中多拷贝Hsp70的细胞功能,发现两个高度保守的PRK00290亚型出现功能歧化现象。黄色黏球菌DK1622共编码15个Hsp70家族蛋白,通过系统发育关系分析,本文选取了其中来自三个不同亚型的六个蛋白（2个PRK00290蛋白、3个CbnR蛋白和1个cd10170蛋白）进行细胞功能探究。结果表明,两个高度保守的PRK00290蛋白在黏球菌复杂的细胞活动中扮演了极为重要的角色。其中MxDnaK1蛋白的表达量极高且不可敲除,并且其不可敲除的特性并非是由其极高的表达水平造成的。此外,MxDnaK1的表达水平受热激明显上调,表现出典型的热激蛋白的特征。另一个PRK00290蛋白——MxDnaK2则参与了大量多细胞行为:敲除mxdnaK2基因会导致多细胞子实体的形成受损,大量降低细胞的生孢率并且严重影响细胞的S运动过程。此外,MxDnaK2蛋白还在黄色黏球菌的抗氧化过程中起到了极为重要的作用。相比之下,其它Hsp70同系物则仅参与了生孢过程和抗氧化过程,并且在其中的作用明显小于MxDnaK2。因此,MxDnaK1和MxDnaK2承担了重要的生理功能,并且二者之间出现了明显的功能歧化现象。三、鉴定MxDnaK1和MxDnaK2的底物,并对比二者的底物差异。为了探究MxDnaK1和MxDnaK2发生功能歧化的原因,本文鉴定并对比了二者之间的底物差异。尽管MxDnaK1和MxDnaK2的底物在结构、分子量和等电点方面没有明显差异,二者却在很大程度上不重叠,两个MxDnaK各自有大量独特的底物。其中,MxDnaK1倾向于结合缺少疏水内核的蛋白,这些蛋白在高温的情况下更加不稳定,这体现了 MxDnaK1作为热激蛋白的重要功能。相比之下,MxDnaK2特异性底物和MxDnaK1/2共同底物则倾向于膜蛋白,这一特点与它们底物的COG功能分类结果相一致,而MxDnaK1特异性底物的亚细胞结构定位与大肠杆菌中热激诱导型的Hsp70类似。此外,二者在辅伴侣蛋白结合方面也有明显的差异。这些结果表明,MxDnaK1与经典Hsp70有相似的转录调控方式和底物偏好,而MxDnaK2则进化的更适应于黄色黏球菌一些特有的细胞生理过程。四、探究不同功能域对MxDnaKs的影响,证明NBD区域主导了 MxDnaK1和MxDnaK2的功能歧化。蛋白模建和序列分析显示,两个MxDnaKs的NBD和SBDβ区域高度保守,其结构差异主要集中于SBDα和CTT区域。然而实验结果显示,置换NBD会严重破坏MxDnaKs的细胞功能,从而使置换菌株表现出和敲除菌株完全一致的表型缺陷。此外,NBD的置换会导致MxDnaK2的底物数量大幅锐减,并对辅伴侣蛋白的结合造成巨大的影响。相比之下,置换SBDβ会导致减弱的表型缺陷和底物结合能力,而置换SBDα和CTT几乎不产生任何影响。体外实验结果证明,置换NBD不会破坏MxDnaKs不依赖于辅伴侣蛋白的保护活性,却会导致MxDnaK1和MxDnaK2蛋白的寡聚化现象出现逆转,这可能是NBD区域在功能歧化中发挥重要作用的关键原因。因此,MxDnaKs中高度保守的NBD区域反而主导了它们之间的功能差异。总之,本文通过在原核生物基因组中的生物信息学分析和在黄色黏球菌DK1622中进行的一系列实验工作,对Hsp70蛋白的功能歧化和分子机制进行了深入探究。不仅阐明了多拷贝hsp70s在原核生物中的存在情况,还发现了 DK1622中不同Hsp70的功能歧化现象,并从底物识别和结构差异的角度探究了功能歧化的分子机制。这些研究成果可能对原核生物中蛋白质的质量控制、重复基因的功能歧化、细菌的抗逆方式等多方面的研究有借鉴意义,也为生物中大量功能特化的Hsp70的研究提供了一定的参考价值。