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霉菌毒素是由真菌产生的一种具有毒性的代谢产物。赭曲霉毒素A(OTA)是存在于谷物、饲料等农产品中的一种霉菌毒素,而伏马毒素B1(FB1)是主要存在于玉米及玉米制品中的一种致癌物。因此,霉菌毒素精准检测技术的开发对于保障食品安全至关重要。为此本文基于特异性核酸适配体建立OTA和FB1的检测方法。 核酸适配体是一种特异性识别靶分子的单链寡核苷酸(RNA或 DNA),具有较强的亲和力。PicoGreen是一种可以定量检测双链DNA且不受单链DNA影响的荧光染料,在激发波长480 nm处有最大荧光。为了开发针对霉菌毒素的快速检测技术,本研究利用核酸适配体及PicoGreen染料的特点,建立了一种基于核酸适配体快速检测赭曲霉毒素A和检测伏马毒素B1的方法。 结果表明本研究建立的PicoGreen/适配体方法的最优反应缓冲体系为:10 mmol/L Tris,120 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)。本研究使用的OTA核酸适配体序列为:5-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA A-3。该核酸适配体与 OTA结合后,未结合的核酸适配体与互补链杂交生成双链DNA,PicoGreen与双链DNA反应3 min后激发产生的荧光达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。该方法检测赭曲霉毒素A的灵敏度为:1μg/L;检测范围为:1μg/L?200μg/L。OTA核酸适配体与黄曲霉毒素B1、伏马毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法与基于抗体的ELISA方法符合(Kappa值为:0.885)。 本研究利用FB1核酸适配体和PicoGreen建立检测FB1的方法,最低检测限为0.1μg/L,线性范围为0.1μg/L?1μg/L。整个检测流程可在45min内完成。特异性试验表明,适配体方法特异性强,与靶标霉菌毒素以外的常见霉菌毒素无交叉反应。结果表明适配体方法与商品化的基于抗体的ELISA方法非常符合(Kappa值0.857)。 由于核酸适配体比抗体成本低,检测时间短,本研究建立的基于核酸适配体的方法比ELISA方法更具有市场竞争性和推广应用价值。