脓毒症是一种由感染引起的临床综合征,是人类死亡的主要原因之一,仅在美国每年就有约215000人死于脓毒症,花销约有167亿美元,在世界范围内加重了卫生资源的负担。由于人们对脓毒症的认识还有很多不足之处,这类疾病的后期病死率极高,超过50%。脓毒症机体全身炎症状态存在两种不同的免疫反应：全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)特点是产生过多促炎性介质因子,使机体早期处于高炎症反应状态,而随后发生的代偿性抗炎症反应综合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome, CARS)则使机体逐渐转入低炎症反应状态。在SIRS发展到CARS的过程中,机体内促炎性介质因子和抗炎性介质因子可达成某种平衡,称为混合型拮抗反应综合征(mixed antagonists response syndrome, MARS)。SIRS与CARS的失衡或扩大化,均会导致宿主发生不恰当的炎症反应,或因过激的炎症反应或因免疫功能抑制而受到间接伤害。建立标准化的脓毒症动物模型是探索脓毒症的病理机制和预防干预的需要。脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔,且造成腹腔内感染相对比较容易,因此腹腔感染模型是目前最常用的脓毒症动物模型。盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)满足脓毒症动物模型必备的基本要求：(1)符合脓毒症典型的高排低阻血流动力学表现和高代谢状态。(2)伴发多器官功能障碍。(3)较高的自然死亡率。一般要求动物模型的自然死亡率达到50-70%。(4)脓毒症是严重感染引起机体的炎症反应过度激活,从而造成的自我损伤,而不是细菌和内毒素对机体的直接伤害,因此出现器官功能障碍、动物死亡应该与脓毒症模型制备有一定的时间间隔。一般在制模6-12h后发生的器官功能障碍或死亡属全身炎症反应所致。因此,用CLP制成动物脓毒症模型,病程同脓毒症患者类似,制模操作简单,适应不同研究目的的需要,是目前较为理想的脓毒症动物模型。研究脓毒症中涉及的调节因素,尤其是内源性调节因子,是一个重要的课题。这不仅是对脓毒症病理生理机制的探索,而且对脓毒症的有效治疗有重大的指导意义。第一部分Caveolin-1通过调节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺细胞凋亡从而对脓毒症小鼠起到保护作用研究背景Caveolae一词是拉丁语小的凹陷的意思,是脂筏的一种类型,是细胞膜表面特定的直径约50-100nnm的一个微型结构区域,富含胆固醇、鞘磷脂和蛋白质。Caveolae不仅含有特殊的脂质成分,还含有大量的信号传导分子,为细胞信号传导提供了一个作用平台。Caveolin-1是一个24kDa的蛋白,是caveolae的主要组成蛋白,而且被看作是caveolae的标记蛋白。Caveolin-1基因的敲除会导致caveolae的缺失,说明caveolin-1蛋白在caveolae这种特殊结构的组装过程中发挥了关键作用。Caveolin-1在多种细胞生理病理功能方面都发挥了重要作用：(1) Caveolin-1参与胞吞和吞噬作用；(2)Caveolin-1参与胆固醇转运和胞内胆固醇调节；(3)Caveolin-1参与细胞信号转导的调节等。因此,人们发现caveolin-1与多种疾病的发生发展都有密切的关系,如肿瘤、糖尿病和心肺疾病等。最近有文章报道caveolin-1参与机体的免疫调节。但关于caveolin-1的这项功能,不同的文章有看似相反的报道。用细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激作为内毒素血症的模型,人们观察到caveolin-1敲除小鼠更能耐受LPS引起的炎症性肺损伤。但用伤寒沙门氏菌或铜绿假单胞菌刺激小鼠,caveolin-1敲除小鼠则表现出较高的死亡率。这些研究证明caveolin-1对LPS和细菌感染的反应是不一样的,而且以上研究所用的炎症模型都不能较好地模拟临床。内毒素血症和脓毒症的病理生理改变有相当大的区别,我们发现至今尚无有关caveolin-1和脓毒症关系的报道。因此,利用合适的动物模型来研究caveolin-1在脓毒症中所起作用是一个非常有意义的课题。这不仅能得出更为贴近临床的结论,而且也为脓毒症的干预提供一个新的靶点。研究目的探索caveolin-1对动物脓毒症病程的影响及研究此影响的具体机制。研究方法我们用CLP作为脓毒症模型研究caveolin-1在多种微生物引起的脓毒症中的作用。首先我们观察caveolin-1敲除小鼠和野生型小鼠在CLP术后5天的死亡率并观察到了一定差别。然后我们分别从以下4个方面探索caveolin-1的作用机制：(1)衡量caveolin-1对CLP引起的肺损伤的影响。我们检测CLP术后20h两组小鼠肺脏髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性,称量肺湿重和干燥后的肺干重,计算肺湿／干重比来评估肺水肿,利用分离-灌注肺脏模型检测肺脏毛细血管膜通透性。(2)衡量caveolin-1对CLP引起的炎症反应的影响。两组小鼠施以CLP,术后2h、4h、8h、20h时取小鼠血清测量血清中肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-α, TNF-α),白介素-6(interleukin-6, IL-6)和亚硝酸盐／硝酸盐(nitrite/nitrate, NOx)水平。(3)衡量caveolin-1对CLP术后机体含菌量的影响。两组小鼠施以CLP,术后20h时检测小鼠血液、肝脏和脾脏中的细菌含量。(4)衡量caveolin-1对CLP后淋巴细胞稳态和凋亡的影响。两组小鼠施以CLP,术后18h时分离小鼠胸腺和脾脏,用流式细胞术分析组织中淋巴细胞表型,并用Annexin V/PI和TUNEL两种方法检测细胞凋亡。结果(1) Caveolin-1对脓毒症小鼠有保护作用。CLP导致caveolin-1敲除小鼠67%的死亡率,但野生型小鼠死亡率只有27%。(2)Caveolin-1对CLP引起的肺损伤无明显影响。两组小鼠肺MPO活性,肺水肿和肺毛细血管膜通透性无明显差别。(3)Caveolin-1敲除小鼠在脓毒症时炎症反应失控。CLP后野生型小鼠表现出典型的急性期反应,TNF-α和IL-6在脓毒症早期(2-4h)大量产生然后在接下来的时间水平逐渐降低。但与野生型小鼠不同,caveolin-1敲除小鼠在脓毒症期间炎症因子的生成水平一直很高,血清TNF-α, IL-6和NOx水平在CLP术后4h内持续升高,并且在20h时比野生型小鼠高3-4倍。(4)Caveolin-1敲除小鼠在脓毒症时有较高的细菌负荷。Caveolin-1敲除小鼠血液、肝脏、脾脏中均表现出较高的含菌量。(4)脓毒症时caveolin-1敲除小鼠胸腺细胞凋亡增多,淋巴细胞稳态失衡。Caveolin-1敲除小鼠胸腺细胞凋亡明显增多,表现为Annexin V+/PI-和TUNEL+的胸腺细胞均有2倍增加。而且胸腺和脾脏中淋巴细胞稳态失衡,细胞亚群比例失调。结论1. Caveolin-1对脓毒症小鼠起到了保护作用,降低脓毒症小鼠的死亡率。2. Caveolin-1抗脓毒症的作用是通过调节炎症反应、减少细菌负荷、抑制胸腺细胞凋亡等来实现的。3.CLP是较为理想的脓毒症动物模型。研究意义本研究的创新点在于采用一种更好地模拟临床的脓毒症动物模型来验证了caveolin-1在脓毒症中的作用,并从多角度多方面深入探索了作用机制。进一步证明了炎症是一个牵涉多器官组织的复杂的过程,涉及机制繁多。而caveolin-1通过干预多种途径对脓毒症动物起到保护作用,这也为脓毒症的临床干预提供了一个崭新的靶点,并为进一步研究指出了方向。第二部分B类I型清道夫受体通过调节炎症反应对脓毒症小鼠起保护作用研究背景B类I型清道夫受体(scavenger receptor BI, SR-BI or Scarbl)是清道夫受体家族的一员,是一个75kDa的位于细胞膜caveolae里的膜蛋白。SR-BI分布广泛,主要在肝脏及生成类固醇激素的组织中高度表达,如肾上腺、睾丸、卵巢等。在巨噬细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞上也都有表达。SR-BI是目前公认的HDL受体,介导了HDL转运的胆固醇酯选择性地摄入细胞内,参与了胆固醇的逆向转运过程。除此之外,SR-BI还具有多种重要的生理功能：(1)SR-BI介导的内流的胆固醇是合成类固醇类激素的重要原料；(2)血浆中HDL与血管内皮细胞上SR-BI结合,可以激活共同位于caveolae里的内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS),产生一氧化氮(nitric oxide, NO),发挥舒张血管等心血管保护作用；(3)SR-BI抑制过量NO产生的细胞毒性；(4)在没有配体与SR-BI结合的情况下,SR-BI能通过激活caspase-8诱导细胞凋亡；最近有文章报道SR-BI有抗LPS引起的动物死亡的作用。其保护作用来源于SR-BI抑制NO诱导的细胞毒性和SR-BI介导的糖皮质激素合成。这些研究提示了SR-BI可能会在脓毒症中发挥一定作用。鉴于内毒素血症并不能很好地模拟临床,采用合适的脓毒症动物模型来发掘SR-BI在炎症中的作用是一个十分必要的课题。这不仅能够更好地得出延伸至临床的结论,而且也为脓毒症的诊治提供了一个新的靶点。研究目的研究SR-BI在动物脓毒症中的作用并探索其作用机制。研究方法我们采用CLP作为脓毒症动物模型,观察SR-BI敲除小鼠和野生型小鼠在CLP后的死亡率,并观察到了一定的差别。接下来我们采用以下步骤来探索其中的机制：(1)衡量SR-BI对CLP后炎症反应的影响。两组小鼠施以CLP,术后2h、4h、8h、20h时测量小鼠血清中TNF-a, IL-6和NOx水平。(2)衡量SR-BI介导的糖皮质激素合成在脓毒症中的作用。两组小鼠施以CLP,术后2h、4h、8h、20h时测量小鼠血清中皮质酮水平,以及在小鼠施以CLP之前8h在饮用水中添加皮质酮,观察CLP后小鼠的死亡率。(3)衡量SR-BI对巨噬细胞炎症因子产生的影响。我们培养两组小鼠骨髓来源的巨噬细胞,并用LPS刺激,检测分泌的TNF-a和IL-6水平。(4)衡量SR-BI在巨噬细胞上的表达是否与脓毒症小鼠的死亡率有相关关系。我们之前的研究证明第323位氨基酸C突变为G的SR-BI (SR-BIC323G)已经丧失了SR-BI的基本功能,包括摄取胆固醇、调节类固醇激素合成、诱导凋亡、抗NO毒性。因此SR-BIC323G转基因小鼠是一个良好的用来研究SR-BI未知作用的模型。我们用SR-BI敲除背景的SR-BIC323G转基因小鼠和未转基因小鼠来再一次确定SR-BI对巨噬细胞炎症反应的影响及这个影响与小鼠的死亡率的关系。(5)衡量SR-BI对toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)介导的NF-κB激活的影响。HEK-Blue细胞稳定表达TLR4、CD14、MD2和NF-κB启动子。LPS激活TLR4,导致NF-KB启动子的表达,然后能催化HEK-Blue检测液变蓝。蓝色的深浅用650nm处的吸光值来定量检测。我们制备稳定表达野生型SR-BI. SR-BIC323G和pLNCX2质粒的HEK-Blue细胞系,用0、0.5、1、2ng/ml的LPS刺激16h后检测NF-κB的激活。(6)衡量SR-BI在脓毒症时对脂蛋白的影响。两组小鼠施以CLP,术后20h时采血,用快速蛋白液相色谱分析血清脂蛋白分型。(7)衡量SR-BI在脓毒症时对血浆LPS清除的影响。两组小鼠施以CLP,术后4h、8h、20h时取血检测血浆LPS水平。结果(1) SR-BI对脓毒症小鼠有保护作用。在CLP后72h时SR-BI敲除小鼠的死亡率是100%,而野生型小鼠的死亡率只有21%。(2)脓毒症时SR-BI敲除小鼠固有免疫反应异常。野生型小鼠表现出典型的急性期反应,TNF-a和IL-6在脓毒症早期(2-8h)大量产生然后在接下来的时间水平逐渐降低。与野生型小鼠不同,SR-BI敲除小鼠在CLP后4h时血清TNF-a和IL-6水平水平较低,说明脓毒症早期SR-BI敲除小鼠炎症反应延迟。而且在20h时SR-BI敲除小鼠血清TNF-a和IL-6水平持续升高,说明脓毒症晚期SR-BI敲除小鼠体内炎症反应失控性持续发展。NOx的反应类似。(3)SR-BI介导的皮质酮合成对脓毒症小鼠的死亡率无明显影响。补充皮质酮对CLP引起的脓毒症的SR-BI敲除小鼠并无保护作用。(4)SR-BI调节巨噬细胞的炎症反应。在LPS刺激下,野生型巨噬细胞生成的TNF-a在4h达到最大值,IL-6在8h达到最大值。但是SR-BI敲除巨噬细胞持续产生TNF-a和IL-6,在20h时水平超过野生型巨噬细胞。说明无SR-BI表达的巨噬细胞炎症反应失控。(5)巨噬细胞上SR-BI的表达是降低脓毒症小鼠死亡率的原因之一。与未转基因的巨噬细胞相比,SR-BIC323G转基因的巨噬细胞上SR-BIC323G的表达显著抑制TNF-a和IL-6的产生。并且CLP后SR-BIC323G转基因小鼠死亡率明显较低。(6)SR-BI调节TLR4介导的NF-κB激活。SR-BI的存在显著地抑制了LPS刺激下NF-κB的激活,说明SR-BI能调节TLR4信号传导通路来调节炎症反应。(7)脓毒症期间SR-BI对脂蛋白无明显影响。(8)脓毒症时SR-BI加速了LPS的清除。CLP后20h时SR-BI敲除小鼠血浆LPS水平比野生型小鼠较高,而且在脓毒症早期SR-BI敲除小鼠血浆LPS水平比野生型小鼠较低,说明SR-BI同时参与了LPS从炎症部位吸收入血和从血中清除两个过程。结论1. SR-BI对脓毒症小鼠是一个重要的保护性因子,有效降低脓毒症小鼠的死亡率。2. SR-BI抗脓毒症的作用是通过调节巨噬细胞TLR4介导的炎症反应和促进LPS清除来实现的。3.CLP是较为理想的脓毒症动物模型。研究意义本实验采用了一种更能模拟临床脓毒症患者病程的动物模型CLP来验证了SR-BI和脓毒症的关系。SR-BI是公认的HDL受体。我们这一发现将脂代谢中的关键蛋白和炎症联系在一起,强调了SR-BI蛋白的多功能性,说明了生物体的复杂性。这就开拓了我们在实验设计时的想象力,并给我们一个提示,揭示蛋白的多功能是必不可少的任务。机体的各个系统都紧密相关,比如干预脂代谢时可能会影响到机体的炎症免疫。因此本实验为脓毒症的临床干预开拓了一个崭新的视野。