胶质瘤是最常见的中枢神经系统实体肿瘤。在中枢神经系统各种组织学类型的肿瘤中,星形胶质细胞起源的恶性胶质瘤具有迅速增殖、高度血管生成和高度侵袭性的特点。尽管外科手术水平及放疗、化疗技术不断提高,但并没能显著改善脑胶质瘤患者的预后,平均生存期仅为14.6个月。近来,许多研究者先后在肿瘤中发现了具有干细胞特性的细胞,提出了肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSCs)的概念,认为在肿瘤细胞中有一小部分细胞具有自我更新、无限增殖、多向分化潜能的干细胞样特性,是肿瘤发生、转移和复发的根源。而肿瘤中的绝大部分细胞不具有上述特性,无法独立在体内形成种植性肿瘤。肿瘤干细胞是肿瘤的种子细胞,在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用,也是肿瘤对化疗产生耐受以及复发的根源。肿瘤干细胞能凭借其自身更新能力和处于静止期的特性,逃脱药物杀伤作用,从而在放化疗后导致肿瘤的复发。胶质瘤干细胞(Glioma stem cell, GSCs)能特征性的表达三磷酸腺苷结合盒转运体(ATP-binding cassette, ABC转运体),该转运体能将多种药物转运出细胞外,从而对化疗产生耐药；而且还具有很强的修复DNA损伤的能力,从而对放疗产生抵抗。因此胶质瘤干细胞可能是引发胶质瘤并维持其生长的主要细胞来源,在胶质瘤的复发过程中起决定性作用。最近研究发现,胶质瘤干细胞比其相应的分化型胶质瘤细胞分泌更多的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF),胶质瘤干细胞的运动、侵袭能力也强于分化瘤细胞。胶质瘤干细胞通过分泌大量的VEGF促进肿瘤血管生成,对肿瘤生长和侵袭起到了决定性作用。VEGF是一种高度特异性、选择性的血管内皮细胞有丝分裂原,在体外能诱导内皮细胞增生和迁移,同时能抑制内皮细胞凋亡,在体内是血管生成所必不可少的重要参与因子,能促进血管生成,增强血管的渗透性。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)是一种由146个氨基酸组成的具有肝素结合特性的多肽因子,是一种强有力的广谱有丝分裂原,可刺激内皮细胞的分裂和增殖,诱导或促进毛细血管的形成,不但能直接激活内皮细胞的增殖和迁移,还能通过促进VEGF的分泌促进血管增殖和细胞外基质的沉积,间接促进血管生成过程。VEGF和bFGF是促进血管内皮细胞增殖的两个重要的血管生成调节因子,作用于瘤细胞及肿瘤周围的血管内皮细胞而发挥功效,二者存在明确的时间和浓度相关性。当前的脑胶质瘤治疗方法(手术、放疗、化疗)因胶质瘤干细胞的存活而不能达到根治的目的。胶质瘤干细胞在一定条件下可诱导分化成各种子代细胞(包括星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞),如果能将胶质瘤组织内的胶质瘤干细胞首先进行诱导分化,再用常规方法进行治疗可能是有效的方法之一。全反式维甲酸是迄今研究最深入、作用最强的诱导分化剂之一。与全反式维甲酸诱发相关的某些信号途径(如VEGF或bFGF)是否也与胶质瘤的发生发展有联系?全反式维甲酸对这些信号通路在胶质瘤发生发展过程中的作用怎样?目前尚未得知。由此,本实验研究以VEGF和bFGF基因为切入点,探讨全反式维甲酸对人胶质瘤干细胞的促分化能力及其对VEGF和bFGF等相关基因表达的影响,以求从分子信号途径的角度探寻胶质瘤治疗的新途径。为了进一步了解全反式维甲酸对促进胶质瘤干细胞分化并抑制增殖作用及其机制,我们对全反式维甲酸在人恶性胶质瘤细胞系U87中的胶质瘤干细胞的作用进行了研究。首先,我们对U87细胞中具有干细胞特性的细胞进行分离、培养和鉴定；随后,我们探讨了全反式维甲酸对胶质瘤干细胞的细胞增殖和VEGF及bFGF表达的影响。主要结果和结论如下：第一部分人恶性胶质瘤细胞系U87中胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定目的：从人恶性胶质瘤细胞系U87中分离、培养胶质瘤干细胞,并从细胞形态、生长特性、特异性标志物的表达等方面进行鉴定。方法：选择人恶性胶质瘤细胞系U87,分别应用含血清培养基(DMEM/F12+10%FBS)和无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mL bFGF+20ng/mL EGF)培养。通过无血清悬浮培养方法,从U87中培养获得呈悬浮生长的U87肿瘤球；对U87肿瘤球细胞的一般形态、免疫表型、多向分化能力进行观察。结果：人恶性胶质瘤细胞系U87在含血清培养基中呈贴壁生长,长出突起,呈短梭形、长梭形、星形、多角形；U87胶质瘤细胞在无血清培养基中,则呈悬浮状态生长,形成悬浮肿瘤克隆球,这些肿瘤球经0.01%胰酶消化后,能传代至少1个月以上。免疫荧光染色结果显示,人恶性胶质瘤细胞系U87中包含有CD133+细胞,CD133+细胞形成的细胞球表达神经干细胞的标志物CD133和Nestin,不表达分化的星形胶质细胞标志物GFAP;CD133+细胞球在含血清的常规培养中可分化为贴壁细胞,形态与亲本U87细胞相似；CD133+细胞球分化子代细胞荧光染色结果显示,大部分的分化细胞呈GFAP阳性,少部分细胞呈β+tubulin Ⅱ(?)阳性或Galc (?)日性。结论：人恶性胶质瘤细胞系U87中存在具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的胶质瘤干细胞,利用含bFGF和EGF的无血清培养基可对U87中的胶质瘤干细胞进行有效扩增。第二部分全反式维甲酸对胶质瘤干细胞增殖和VEGF、bFGF表达的影响目的：研究全反式维甲酸(TRA)对胶质瘤干细胞(GSCs)增殖和VEGF、bFGF表达的影响。方法：从人恶性胶质瘤细胞系U87中分离鉴定的GSCs,根据培养基中的成分不同分为对照组、空载体组和ATRA组,用CCK8法检测GSCs的增殖效应；于分化后第10天用免疫荧光技术检测GSCs子代分化细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率；采用ELISA法检测细胞上清VEGF、bFGF水平,RT-PCR法检测细胞VEGF和bFGF mRNA的表达。用SPSS13.0对数据进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析.以P<0.05认为差异有统计学意义。结果：免疫荧光染色结果显示,ATRA能显著增加分化子代细胞GFAP阳性百分率(P<0.01)；CCK-8结果显示,培养第1-2天细胞增殖不明显,第3-7天为增殖高峰期；对照组和空载体组细胞增殖较快,两组之间差异不明显,而ATRA组的增殖速度较前两组明显变缓(P<0.05或P<0.01)。ELISA结果显示,ATRA组GSCs的培养上清中VEGF、bFGF含量显著降低(P<0.05或P<0.01)；RT-PCR结果显示,ATRA组GSCs的VEGF、bFGF mRNA表达显著减少(P<0.01)。结论：ATRA能明显促进GSCs分化,增加其子代细胞中GFAP阳性细胞百分率,并抑制细胞的增殖。ATRA可以从基因水平抑制GSCs的VEGF和bFGF的分泌和表达。促分化治疗可以作为治疗恶性胶质瘤的新靶点。