论文部分内容阅读
研究背景与目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,且其发病率呈逐年上升的趋势。目前临床上对于不具备手术适应症、对放疗不敏感以及术后需要辅助化疗的患者,药物治疗是必不可少的手段。对某些表达相对特异性受体,如雌激素受体(ER)、孕激素受体(PgR)或人类表皮生长因子受体2(HER2)的乳腺癌患者可采用抗雌激素药三苯氧胺、芳香化酶抑制剂来曲唑或HER2克隆抗体曲托珠单抗等进行治疗。由于乳腺癌患者对上述药物具有一定的敏感性,故药物治疗可取得相对满意的临床疗效。由于特异性受体阴性的乳腺癌侵袭性更高,且缺乏相对特异性的靶标,故目前只能采用传统的细胞毒药物,如环磷酰胺等进行治疗,故这些患者的临床预后普遍较差。因此,研究乳腺癌,尤其是ER阴性乳腺癌细胞增殖和凋亡的关键分子和调节机制,并发现新的治疗靶标和候选药物对于提高乳腺癌患者的临床预后就显得尤为重要。已知花生四烯酸代谢网络活性异常与结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌等多种人恶性肿瘤的发生和发展密切相关。肿瘤细胞膜磷脂可经磷脂酶A2(PLA2)作用释放花生四烯酸,再通过环氧酶(COX)、脂氧酶(LOX)和细胞色素P450单加氧酶等花生四烯酸代谢网络关键酶催化分别生成前列腺素、白三烯和羟基二十碳四烯酸(HETEs)等类花生酸,并进一步激活PI3K/Akt等下游信号通路,从而在肿瘤细胞增殖和凋亡调节中起重要作用。因此,目前以花生四烯酸代谢网络及其信号通路为靶点的抗肿瘤新药在某些人肿瘤如结肠癌等的防治方面已进入临床研究阶段并显示了良好应用前景。因为乳腺癌亦高表达花生四烯酸代谢网络关键酶(如COX、LOX以及细胞色素P450单加氧酶等),且CYP4家族与人乳腺癌血管生成关系密切,所以,乳腺癌及其基质细胞中的花生四烯酸代谢网络有望成为乳腺癌防治的新靶标。异甘草素(2’,4’,4-三羟基查耳酮)是从甘草中分离提取的一种黄酮类化合物,具有植物雌激素的活性。尽管人体内源性雌激素对乳腺癌有促进作用,但目前研究普遍认为植物雌激素是乳腺癌的天然化学预防剂,但其具体机制尚无圆满解释。目前,有研究认为低剂量的异甘草素对雌激素受体表达阳性的MCF-7乳腺癌细胞具有的促增殖作用,而在高剂量时则具有抗增殖活性。因而有关异甘草素对乳腺癌细胞增殖的影响有互相矛盾的报道。迄今为止,异甘草素对雌激素受体阴性乳腺癌细胞的作用尚未见报道。鉴于异甘草素可通过抑制花生四烯酸代谢网络关键酶COX-2表达从而诱导小鼠结肠癌细胞凋亡,以及异甘草素可广泛干预其他病理和/或生理状态下机体花生四烯酸代谢网络,本文从花生四烯酸代谢网络关键酶及其相关下游信号通路的角度,而不是从传统特异性受体的角度,研究异甘草素对人乳腺癌细胞凋亡的诱导作用以及对植物雌激素预防乳腺癌的机制作出合理的解释,试图为抗乳腺癌新药的研发提供靶标和候选药物。方法：采用新型四唑氮盐法(MTS)、5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入法和克隆形成实验检测异甘草素对MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞的生长抑制作用；采用细胞质组蛋白相关DNA片段法、流式细胞术和Hoechst33258荧光染色法研究异甘草素对MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞凋亡的影响,并在MDA-MB-231人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中采用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法研究异甘草素对乳腺癌细胞凋亡的影响；采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)法测定异甘草素对MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、FLAP和CYP4A11mRNA表达的影响；采用酶联免疫分析(EIA)法和液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)分别测定异甘草素对MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌细胞培养上清中前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)和20-羟二十碳四烯酸(20-HETE)含量的影响；为了进一步阐明异甘草素诱导乳腺癌细胞凋亡的机制,采用Western blot法测定PI3K/Akt通路和凋亡相关蛋白表达,同时测定凋亡酶活性和线粒体细胞色素C释放；最后在MDA-MB-231人乳腺癌裸鼠移植瘤模型中研究了异甘草素的体内抗肿瘤效应及其机制。结果：异甘草素浓度依赖性明显减少MCF-7和MDA-MB-231细胞存活率、BrdU掺入和集落形成能力,并显著诱导其凋亡；异甘草素不仅显著抑制人乳腺癌细胞花生四烯酸代谢酶(PLA2、COX-2和CYP4A11) mRNA表达,同时减少反映酶催化活性的产物(PGE2和20-HETE)生成；外源性给予PGE2、LTB4和20-HETE类似物(WIT003)均可显著逆转异甘草素诱导的人乳腺癌细胞凋亡；异甘草素可下调人乳腺癌细胞PI3K、Akt (Thr308位点)和Bad(Ser136位点)磷酸化,同时降低Bcl-xL表达,从而活化Caspase级联反应并导致聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解水平显著增加。泛Caspase抑制剂(z-VAD-fmk)和Caspase-9特异性抑制剂(z-LEHD-fmk)预处理,或腺病毒载体导入外源性Akt均可显著降低异甘草素诱导的人乳腺癌细胞凋亡。在裸鼠移植瘤模型中,异甘草素可显著诱导乳腺癌生长抑制和细胞凋亡,且造血功能、肝功能和肾功能均无异常变化。同时异甘草素还可降低在体肿瘤类花生酸生成,下调磷酸化Akt (Thr308位点)水平,增加Caspase-3和PARP裂解,这进一步验证了离体实验关于其抗肿瘤机制的研究。结论：异甘草素对雌激素受体表达阳性或者阴性的人乳腺癌细胞均体现明确的生长抑制和凋亡诱导作用。异甘草素抗人乳腺癌的机制在于下调花生四烯酸代谢网络关键酶PLA2、COX-2和CYP4A11,并抑制其下游的P13K/Akt信号通路以及激活内源性细胞凋亡途径。异甘草素在显示抗肿瘤效应的剂量下没有出现明显毒副反应。以上结果表明,花生四烯酸代谢网络关键酶是治疗人乳腺癌的新靶点。异甘草素及其衍生物有望成为抗人乳腺癌的候选药物。